由于朱元璋对皇后的崇敬，多次要对马皇后的家族亲戚封官进爵，都被她婉言拒绝了。她说：“历史上由于外戚干政而危害国家、残害百姓的教训是值得永远铭记的。国家的官爵俸禄，应当给那些具有真才实学、品德高尚的贤达之士，不应作为皇家私产，随便送给皇亲国戚。”
洪武三年（1370），明朝大军在击败残元势力的斗争中，缴获了一尊宋元以来的传国玉玺，对此，不只朱元璋异常欣喜，举国上下也为之欢庆。只有马皇后不为所动，平静如常。朱元璋问她：“皇后难道不觉得我大明开国之初，即能得此传国宝物，乃朕之大幸、国之大幸吗？”马皇后答道：“宋、元都曾拥有过这传国之宝，可还是没有守住江山。看来，作为一国之君应当拥有的不只是一尊传国玉玺，而是其他更为重要的宝物啊。”朱元璋是个聪明人，立刻领悟了皇后的意思，接茬说：“皇后是说，国家的真正宝物应当是贤臣良将、国之栋梁。”马皇后听了，甜甜地一笑说：“皇上英明。”
马皇后对待后宫的众多嫔妃、宫女，都不分亲疏，情同姐妹，教育她们读书识字，严格遵守后宫规矩和礼法，相互不得嫉妒嫌弃，要亲如一家。为了让她们懂得更多的道理，她协同女史官，编写了《宋代家法》，供后宫众人学习；还把宫内戒训，书写在铁牌上，挂于六宫，使嫔妃们朝夕可见。生活上要求大家坚持勤俭，不得攀比吃喝穿戴。她以身作则，就连皇上的内衣破旧了，她都亲自浆洗缝补好了继续穿用。哪个妃子生育子女，她都给予真诚的关心和照顾。她对亲生的三个儿子、两个女儿和众妃所生子女都视如己出，除了母爱，还有严格的管教。要求他们努力学习、通达事理。担心他们生在帝王之家，不知百姓疾苦和衣食的来之不易，便要他们节衣缩食，爱惜财物。对皇帝的一日三餐她也亲自管理。有人说这事有御膳房，不必皇后操心。她则说：“我之所以这样做，一是作为妻子，我要对他的饮食负责；二是，如果皇帝对某些饮食不中意，只能怪罪我，而不会责难甚至处罚别人。”
对于嫔妃宫女除了严格约束，还特别关心她们的疾苦难处。有一次，朱元璋盛怒之下，要惩处一个宫女，那个女孩吓得浑身哆嗦。马皇后见了，心生一计，也装做很生气的样子说：“这小丫头也太不懂事了，把她捆起来交给宫正司治罪。”朱元璋见后宫之主把这件事揽过去了，便不再过问。而马皇后很快便背着他，令人把那宫女放了回来，严肃而不失尊严地批评了她，嘱她以后要谨慎小心。类似的事情还很多，她这样做，既维护了皇上的尊严，又为宫中下人们免除了惩罚之苦。
由于马皇后严格有度的治理，明代后宫在一百多年间，一直保持良好风气。
有些王侯将相的命妇进宫朝见，马皇后总是以家人之礼接待，对她们的家人子女极为关怀，问长问短。谁家有什么困难，她都竭力帮助解决。和州知府郭景祥的儿子不孝，扬言要杀死自己的父亲。朱元璋得知后，以大不孝罪治他死刑。郭景祥的夫人请见皇后，说明儿子虽然不尽人意，但不至于处死。马皇后很同情这位母亲，便答应替她在皇上面前说情。她对朱元璋说：“有人说郭的儿子要杀死乃父，本是传言，很可能失实。郭家就一个儿子，杀了他就绝后了，这是万万不可轻率的事，请陛下详察后再做定论。”朱元璋接受了皇后的意见，经调查，果然系讹传。朱元璋又免了郭子的死罪。
朱元璋刚刚称帝时，要重修南京城墙。由于多年战乱，国库空虚。而重修京都城墙，是需要大量资金的。恰好，南京城里有个富商沈万三，人称“货柜万万，田产遍吴下”，是江南第一大财主。他听说皇帝要耗巨资修筑城墙，便挺身“请战”，自己要负责修建一面城墙。朱元璋不喜欢他那财大气粗的样子，便故意为难他，对工程质量要求严苛。而不识相的沈万三仍不知收敛，竟说：“质量要求多高都没关系，不就是多花些银子嘛，那对我来说，只不过是九牛一毛的事。我还想犒劳大明的全体官兵呐。”这话很快传到朱元璋的耳朵里，他生气了，把沈万三诏到宫中对他说：“沈万三，听说你要犒劳官兵，你可知道朕有多少军士？”沈万三跪着摇头。“百万大军，你犒劳得起吗？”朱元璋在说这话是用了“高八度”的。而仍不知趣的沈万三竟然笑嘻嘻说道：“陛下，我原来以为大明得有几百万官兵，才一百万啊。这么点人，我可以发给每人一两银子”，他在说这后两句话时口气还有点轻蔑。这下子可就大大刺激了朱元璋。他想：一个富可敌国的商人，竟敢在天子面前如此放肆，太不知天高地厚了，我必须杀掉他以震慑类似的富豪们。马皇后知道了皇帝的决定后，立即劝解说：“陛下，先消消气，这个有钱没有脑子的沈万三，也真的太狂妄了。但他的错误只是没心没肺，说话不知检点，并没有反叛之心，也没有犯其他的罪，杀死他是没道理的。念他肯于出资助国，不要杀了他吧。”朱元璋怒气未消，但面对皇后他不好意思继续发作，便冷冷地对左右说：“皇后说的有道理，朕决定不杀他了。但流放云南，让他吃吃苦，也好收敛收敛他的狂劲儿。”马皇后又救了一条命。
朱元璋青少年时因为家境贫寒，没有受过多少正规教育，做了皇帝以后他和马皇后都觉得没有知识是治理不好国家的，所以都很重视教育。马皇后在后宫，非常重视皇室子弟的学习，教育他们要尊重师傅，不可有丝毫懈怠。皇子们长大受封为王以后，她依然不放松管教。三皇子朱樉受封为秦王，驻地西安。他从小性情放荡，马皇后担心他离宫赴任后行为不轨，便命人品端庄的江贵妃带着皇后经常穿戴的衣帽和手杖，随同前往，嘱托她说：“秦王还年轻，在王位上如果有什么不轨行为，你可以穿戴我的衣帽、用这手杖代我责打他，直到他认错改正为止。”
在社会上她也主张建立学校，更多地培养人才。朱元璋支持她的意见，便在京师建立了太学，学生有几千人之众。马皇后在高兴之余，又想到这些年轻人来京城读书，有些人家中本来贫困，这下又缺少了一个劳动力，生计更不好维持。便向皇帝建议，由官府给每个学生按月提供银粮，养活自己兼济家庭。并将这种做法成为一种制度，在明代一直实行。
洪武十五年（1382）春夏之交季节，马皇后患了重病。朱元璋忙命御医们精心诊治。但马皇后面对御医们却诚恳地说：“先生们，这么多年，你们在宫中对皇上、太子以及诸皇子的大病小恙都尽心治疗，维护了他们的身体健康，我非常感激你们。现在我病了，自觉是不治之症，就不用你们费心劳神治疗了。大家回去吧。”御医们都非常敬佩皇后的贤德，现在她患了重病，哪能袖手一旁呢，忙齐声请求说：“皇后一向关怀、体恤宫中下人，我们都非常关心您的健康，现在您偶感风寒，不会有大碍的。我们的医术虽然平平，但会尽心尽力的。”马皇后见他们如此执著，便改用严厉口气说：“我就是不愿意用你们，别再罗嗦了。下去吧，我要休息。”御医们还从没见过皇后如此严厉，便不敢再坚持，悄悄退下了。后来，一位她最喜欢的皇妃问她为什么这样做，她叹了一口气说：“我真的知道自己的病很不容易治愈，如果让御医们着手治疗，而最后又没有效果，我还是魂归西天了，依皇上的脾气，肯定要加罪御医们，或许会开杀戒。我不忍心因为自己而坑害他们。”御医们知道了马皇后的良苦用心后，都感动得失声痛哭。
马皇后逝世时，才五十一岁，葬于南京的一块风水宝地——明孝陵。临终前，朱元璋紧紧握着她的手问她还有什么话要说，她拼着最后的气力亲切地说：“臣妾与陛下相识相伴三十年，我们共同生育了三儿两女，这是我们生命的继续。我死后希望陛下要爱护和严格管教他们，对其他皇妃所生子女，要一视同仁，不可偏爱。在军国大事上，希望陛下坚持求贤纳谏，慎终如始。博爱少杀，体恤民疾。”说完，便闭上了她那双永远放射着智慧、通达和慈爱之光的眼睛。
朱元璋痛哭不已。面对皇后的遗体发誓，永远不再册立皇后。
宫中上下得知皇后死讯，无不悲痛。后宫的嫔妃宫女们哭后做歌，反复吟唱：“我后圣慈，化行家邦。抚我育我，怀德难忘。于万斯年，毖彼下泉，悠悠苍天。”