这个电报态度平和而措辞委婉，并且作出重大让步，博得许多中间派人士的同情。国民党当局却把这种让步视为软弱可欺。军令部秘密拟具了《剿灭黄河以南匪军作战计划》，于11月14日上报蒋介石批准。白崇禧甚至扬言："此次对于军事已有把握，不致再败。"云云。12月9日，蒋介石亲自命令，限在12月31日前，将黄河以南的八路军开往黄河以北，长江以南的新四军开到长江以北；而在第二年一月三十日前，将新四军全部开到黄河以北。第三天，蒋介石密令第三战区司令长官顾祝同：该战区对江南匪部，应按照前定计划，妥为部署，并准备如发现江北匪伪竟敢进攻兴化或至限期（本年十二月卅一日止）该军仍不遵命北渡，应立即将其解决，勿再宽容。
1941年1月3日，蒋介石商议对中共新四军等策略。4日，奉命北移的新四军军部和它的直属部队9000千多人，离开军部原所在地皖南泾县的云岭，准备经苏南前往江北；6日，在行经泾县茂林地区时突然遭到已在此设伏的由第三战区第三十二集团军总司令上官云相（北伐时收编的孙传芳旧部）率领的重兵8万多人包围袭击。9日，蒋介石在日记中写道："江南新四军残部既已冲突，应积极肃清，中共以现势决不敢以此叛乱也。"新四军部队奋战7昼夜，终因寡不敌众又处在极端不利的峡谷中，除两千多人突围到皖北、苏南外，大部牺牲或被俘。军长叶挺在同国民党军谈判时被扣。副军长项英在突围时被叛徒杀害。1月16日，蒋介石在日记中写道："为新四军事研究颇切，然决心甚坚，对此事正应彻底解决，以立威信，而振纪纲，即使俄械与飞机停运亦所不惜也。"17日，他反诬新四军叛变，通令取消新四军番号，宣称要把叶挺交付军法审判。这就是震惊中外的皖南事变。
在国民党当局制造如此骇人听闻的惨剧，并且磨刀霍霍准备进一步行动的情况下，中共中央军委在20日宣布命令，由陈毅代理军长、刘少奇为政治委员，在苏北重建新四军军部，并且成立7个师。毛泽东在同天以中共中央军委发言人的名义发表谈话。他说：中国共产党已非1927年那样容易受人欺骗和容易受人摧毁。中国共产党已是一个屹然独立的大政党了。我们还是希望那班玩火的人，不要过于冲昏头脑。我们是珍重合作的，但必须他们也珍重合作。老实说，我们的让步是有限度的，我们让步的阶段已经完结了。他们已经杀了第一刀，这个伤痕是很深重的。他们如果还为前途着想，他们就应该自己出来医治这个伤痕。
皖南事变的善后
当时，许多人以为1927年的四一二政变又将重演。但这场事变是在全民族抗战正在紧张地进行的时刻发生的。大敌当前，中国共产党几经斟酌，考虑过多种对策（包括进行军事反击），最后决定采取军事守势、政治攻势的方针，发动了强大有力的政治攻势。国民党当局1月17日的通令一发表，周恩来就在《新华日报》上刊出两幅他的题词手迹：一幅是"为江南死难者致哀"；一幅是"千古奇冤，江南一叶，同室操戈，相煎何急"。这饱含悲愤的25个字，轰动重庆山城，传遍全国，产生了强烈的震撼人心的力量。罗隆基回忆说：这件事震动了全国人民。当时在重庆的民主人士和在野党派的领袖，奔走相告，认为在抗战时期两大党的武力冲突是国家极大不幸的事情。这将影响整个中华民族的命运。
经周恩来审定的《新四军皖南部队惨被围歼真相》在重庆秘密散发。很多中间派人士又从事实中看到，这次是国民党把事情做到如此决绝的地步，因此破裂的责任完全在蒋介石方面，人们的同情越来越多地转到中国共产党方面来。毛泽东2月14日致电周恩来，对时局作了这样的估计：蒋从来没有如现在这样受内外责难之甚，我（引者注：指中国共产党）亦从来没有如现在这样获得如此广大的群众（国内外）。目前形势是有了变化的，1月17日以前，他是进攻的，我是防御的；17日以后反过来了，他已处于防御地位，我之最大胜利在此。只有军事攻势才会妨碍蒋之抗日，才是极错误政策。政治攻势反是，只会迫蒋抗日，不会妨蒋抗日，故军事守势、政治攻势是完全正确的，二者相反正是相成。只要此次高潮下降，剿共停顿，将来再发动高潮，再举行剿共，就困难了，故目前是时局转变关头。
在国际上，也普遍反对蒋介石这样做。英、美害怕由此引起大规模内战，不利于他们以中国牵制日本的目的。英国驻华大使与周恩来面谈后，劝告蒋介石停止国内冲突，处理问题不要操之过急，以免造成事变。英国政府也向蒋介石表示：内战只会加强日本的攻击。美国总统罗斯福的代表居里来华访问。他对蒋介石声明：美国在国共纠纷未获解决前，无法大量援助中国，中美间之经济财政等问题不可能有任何进展。蒋介石在2月1日的日记中写道："新四军问题，余波未平，美国因受共党蛊惑，援华政策几乎动摇。"苏联驻华大使潘友新也向蒋介石当面提出质问。日军又乘此以15万多兵力向豫南发动猛烈攻势。
蒋介石发动皖南事变，原以为时机有利，不会在国内外遭到大的反对，日本会感到高兴，至少会保持中立。局势的发展完全出乎他的意料之外。他对中国共产党态度的坚决，对国内舆论的强烈不满，对国际社会的反响，甚至对日本的动向，都估计错了。他既想大举反共，又要维持继续抗日的局面，事实上是行不通的，使他在国内外都陷入异常孤立和进退失据的被动境地。5月6日，他在第二届国民参政会第六次会议上说：绝不忍再见所谓剿共的军事，更不忍以后再有此种剿共之不祥名词，留于中国历史之中。以后亦决无剿共的军事，这是本人可负责声明而向贵会保证的。因此，他恳切希望中共能本着"兄弟阋于墙，外御其侮"的精神，与国人"精诚团结，共赴国难"。重庆国民党的《中央日报》这时的社论也同样保证说："只要中共不脱离抗战阵线，事件不致扩大，而剿共事实亦不致发生。"
对于蒋之演说与参政会通过之涉及中共军队及政权问题的提案，周恩来肯定其仍为防御性的，毛泽东则称其为"阿Q主义，骂我一顿，他有面子，却借此收兵，选举（董）必武为常驻参政会员及近日西安放人，似是这种收兵的表现"。然而，蒋既然仍是一打一拉的两面政策，毛亦主张继续其一打一拉的两面政策，把这种拉锯式的斗争继续下去，"直到我们的临时办法各条实际上被承认（主要是扩军、防地、《新华日报》及路上少捉人）"。
蒋介石在参政会上的讲演和毛泽东随后的指示，再清楚不过地表明国共两党这时都在设法缓和。14日，蒋介石与周恩来的谈话中，也不再提起中共军队北移问题了，明确讲："只要听命令，一切都好说，军队多点，饷要多点，好说。"至于不得压迫《新华日报》，以及释放前此扣留的进入边区的中共有关人员和发放通行护照等事，蒋都满口答应下来。据此，周提出可否先解决这些小问题，毛当即表示同意。至4月26日，毛更明确指示周恩来说：可以向蒋"表示我党愿意同国民党继续团结抗日，惟望国民党改变对内政策，并对八路发饷，合理解决新四军问题"。
至此，因皖南事变引起之两党全面对抗局面，至少在形式上算是告一段落了。尽管此后中共一度又提到新四军问题，但仍只限于要求同意整编其"余部"及给予经费方面，再未提出取消蒋令及释放所有人员枪弹等问题。5月日军进攻中条山，蒋介石要求八路军出动配合作战，不论八路军最终是否进行了配合，中共中央指示八路军加以配合仍属事实。至11月参政会二届二次会议召开之际，中共方面甚至更将条件降低到只要"放叶发饷"做到一件即可参加。最后，国民党一件未做，中共权衡利弊还是派董必武和邓颖超参加了这次会议。这意味着，皖南事变之"善后"工作已不复存在，国共两党因为事变所引起的破裂危险，业已消弭于无形之中了。
皖南事变的影响
在这以后，国共关系趋向一定程度的缓和。但是，皖南事变所引起的国共两党关系的重大改变，不是两党形式上的这种妥协所能消弭的。国民党虽然不顾一切地消灭了7000千新四军并宣布撤销了它的番号，但新四军照样存在，并且所占地区及兵力越发扩展与壮大，其在新四军范围内的国民党军队反而一一被驱逐或消灭，国民党其实一无所得。更为重要的是，皖南事变从根本上破裂了两党之间的感情联系。二届一次参政会召开之初，蒋介石就秘密召集国民党参政员，向他们解释说：国共最终总要分家的，对此用不着担心，单从军事上，3个月就可以消灭共产党，问题是目前还不是时候，目前政治上还只能是防御。
从蒋介石国共一定要分裂的密示和国民党军委会办公厅3月18日发布的改"某党"为"奸党"令等事实看，国民党在事变后显然已经正式决定把中共视同"汉奸"，形势许可时必欲"剿灭"。同样，从毛泽东对蒋介石的判断和中共中央所作出的有关决定看，中共方面对与国民党真诚合作，也不再抱有任何幻想。于是，皖南事变自然成了抗战期间国共关系逆转的一道分水岭。事变前，中共军队虽然已经在独立指挥、自行发展，但它仍旧隶属于国民政府之下，至少名义上仍随时呈报并请领军费补充，形式上仍旧使用着统一的货币和遵守着统一的政令法令。国共之间军事上的摩擦冲突也仍可通过正常途径反映或协商。因此蒋之命令或要求，一般总还具有一定的约束力。事变之后，国民政府断绝对中共军队的一切供给与补充，切断了自己与中共军队的一切关系，结果反使自己威信扫地。中共政权与军队从此断绝与国民政府之间的一切上下级关系，自设银行，自发货币，自定法规法令，自行其是，完全脱离国民政府而自行存在，蒋也失去一切命令之权。从此调和两党关系之困难，也就可想而知了。
当然，抗战期间的国共关系也仍旧是受着抗日战争的大形势制约的。即不论国共两党利害关系有多大的不同，国民党如何看不起中共的武装，中共如何看不上国民党，它们最终还是要暂时将自身的利益服从抗日的利益需要。因此，即使国民党内相当一部分领导人早就心存"剿灭"中共的想法，但无论事变前，还是事变后，他们最终都不能不在权衡利弊后，把自己的行动保持在有限的范围之内。同样，中共在遭受了重大损失之后，它本可采取更加激烈的对策，其党内领导人总还是不能不顾及到国民党继续抗日这个事实，因而极力地限制自己实施报复政策的烈度和实行对抗政策的范围。由此可知，在抗战期间，民族矛盾终究是高于两党之间的矛盾的。国共两党不论闹到何种地步，终归还是要走向妥协。