抗战期间，国共关系颇多风雨，但两党关系发生重大变化，却是1941年初的事。在此之前，两党纵有摩擦冲突，仍属局部问题。而1941年1月皖南事变发生后，双方剑拔弩张之程度，离全面破裂以至发生大规模内战，实仅一步之遥。事变最后虽以相互妥协而告收场，但由此而导致的两党感情之对立和实际之分立，已无可避免地决定了两党关系的最终走向。
走向皖南事变之路
武汉失守前，日本侵略军大举向中国内地进攻，蒋介石对抗日的态度还是比较积极的。正面战场也需要八路军在敌后帮助拖住进攻的日军。所以，蒋介石那时不反对、还多次要求八路军深入敌后开展活动。可是，当正面日军压力减轻以后，特别是看到八路军在敌后迅速壮大、中国共产党的影响迅速增长，蒋介石，同时也是国民党主流的态度就发生急剧变化。国民党无法容忍共产党力量无限扩大，担心"国民党失地，日本与共产党分地"，"本党统治之土地，将一失而不易复得"，相信"共党三年来由三万扩大到五十万，再一两年定不止一百万，那时还有国民党活路？"朱德对这种变化也作过生动的说明。他说：开始时，蒋介石让共产党、八路军到敌后去是想借刀杀人，像把孙猴子放在太上老君的八卦炉里烧，看你活得成活不成。可是，他没有想到，共产党、八路军在敌后不但没有被消灭，反而迅速发展壮大起来，这下把他吓死了。武汉失守后，他认为这样下去，抗战胜利了，中国是共产党的；抗战失败了，中国是日本人的。从而加紧反共摩擦。在国民党人看来，"共党三年来由三万扩大到五十万，再一两年定不止一百万，那时还有国民党活路？"
1938年12月，蒋介石在陕西武功县召开军事会议。这次会议不再邀请八路军将领参加，这是他对共产党、八路军的方针发生变化的明显信号。他任命鹿钟麟为冀察战区总司令，无理地要求取消在华北敌后已经发展起来的抗日民众运动，取消已由当地民众选举产生、在工作中卓有成效的抗日民主政权，并且要八路军退出河北。1939年1月的国民党五届五中全会后，当日军向冀中、冀南进行残酷扫荡之际，鹿钟麟的部下却从背后袭击八路军，活埋八路军战士和地方工作人员，使这种摩擦活动大幅度升级。在后方，也多次袭击八路军和新四军的留守机关，捕杀工作人员，制造湖南平江惨案等多次严重事件。
国民党当局如此加紧反共活动，在中共中央看来，认为可能是他们准备对日投降的信号。1939年6月10日，毛泽东在延安高级干部会议上报告说：目前形势的特点在于：国民党投降的可能已经成为最大的危险，而其反共活动则是准备投降的步骤。但他的态度仍是审慎的，又说：只要蒋领导抗战一天我们还是拥护的（当然以抗战为条件），不应对蒋有不尊重的表示。积极帮助蒋与督促蒋向好一边走，仍然是我们的方针。
面对步步进逼而来的逆流，中国共产党不能不严正对待。否则，敌后抗战已经取得的成果将会重新丧失，抗战大局会遭到严重破坏。这年7月7日，中共中央在《抗战两周年纪念对时局宣言》中提出"坚持抗战，反对投降；坚持团结，反对分裂；坚持进步，反对倒退"三大政治主张。9月16日，毛泽东同中央社、《扫荡报》、《新民报》记者谈话中，又向国民党顽固派表明了"人不犯我，我不犯人，人若犯我，我必犯人"的严正态度。
国民党内的顽固派却视中国共产党的克制态度为软弱可欺。到1939年快要结束的时候，国内的政治空气进一步恶化，蒋介石越来越倾向于用军事手段来对付中国共产党。11月1日，他在日记中写道："中国共产党之跋扈与嚣张，以后必甚。叛乱不远矣。"他的最后一句话其实是说，他使用军事手段对付中国共产党的日期已不远矣。这个月的12日至20日，国民党召开五届六中全会，由过去的政治限共为主、军事限共为辅，改变为军事限共为主、政治限共为辅，并发布《防制异党活动办法》，规定：任何假借共产党或八路军与新四军等名义擅自组织武装队伍者，当地驻军得随时派兵解散，不得有误。会后调兵遣将，准备对中国共产党领导的抗日根据地发动军事进攻。
日益恶化的局势使中国共产党人十分焦急。事情越来越清楚：他们原来不希望看到的相当规模的武装冲突也许已难避免。国民党五届六中全会期间，毛泽东在中国共产党内的一次报告中说：我们的团结是有条件的。假如把你们头割掉了，还讲什么团结啦？所以我们讲团结，在必要斗争的时候，我们还要斗争，有了斗争也就会有团结。
这年12月间，第二战区司令长官阎锡山在山西突然向共产党领导下的山西新军（决死队）发动进攻，企图以旧军吞并新军。主要冲突地区在晋东南和晋西北。在朱德、彭德怀统一部署下，八路军有力地支持山西新军进行自卫抵抗。新军在事变中虽然受到一些损失，但旧军并没有达到他们原定的消灭新军的目的。事变中，新军部队分别集中于晋西北、晋东南两个地区，加入一二○师、一二九师战斗序列。这以后，新军事实上成为八路军的一部分。为了避免国共合作的破裂，根据中共中央的决定，在山西仍对阎锡山做了一些让步，把吕梁山的大部分地区让给他，八路军只控制一小部分地区和一条通道。这样，山西的矛盾暂时缓和下来。蒋介石在日记中写道：对共党此时应先严密防范，相机制裁。
不久，河北的摩擦又进一步升级了。当时，冀察战区政治部主任和河北省政府民政厅长由九十七军军长朱怀冰兼任；察哈尔省政府主席兼保安司令由石友三担任，也在河北境内活动。1940年1月27日，蒋介石在日记中写道："倭寇之势已衰，抗拒之力有余。且后方共匪无几，其力全在战区。故抗倭剿共可以双管齐下。且共匪夹在敌我之间更易为力。此则抗战之初共匪调往前方之效。"他再次下手了。2月28日，朱怀冰部突然袭击冀南磁县八路军驻地，杀害八路军指战员100百多人；还打着军令政令统一的旗号，要八路军把河北已建立的根据地让给他。
朱德后来叙述当时情况说："朱怀冰蛮横地问，究竟是让，还是打？我就对他说：我们建立根据地是为了抗日，为什么要让？你要晓得，我们改编为八路军以来，没有打过内战；但是，你要打，我们一点也不怕。"3月4日，八路军在卫河以东抗击石友三部的进攻。（不久后，石友三因通敌罪证确凿，被国民党当局处死。）接着，八路军又打垮了前来进攻的朱怀冰部。朱德、彭德怀在3月13日致电八路军各将领，阐述反摩擦斗争的方针："今天中国人民的主要敌人是日本帝国主义，主要的斗争方式是对日寇的武装斗争，这是丝毫不能放弃的。在抗日民族统一战线中也是用武装斗争方式，这是统一战线的不幸。但为着争取坚持抗战、团结、进步政治路线的胜利，这是必要的，这是要由上层资产阶级负责的。倘若没有今天反摩擦的局部武装斗争，就必然会分裂，而发展为全部的武装斗争，那是我们不希望的。"
反摩擦斗争对中国共产党说来，毕竟是迫不得已的自卫行动，因此，在给来犯者以一定惩罚后便适可而止。八路军在敌后战场上依然集中力量打击日本侵略军。这年3月19日，日本华北方面军召开所属各兵团参谋长联席会议。方面军参谋副长平田正判少将就该年作战实施要领作了说明。他对讨伐目标之重点这样说："共产军对我占据地区之进出，活动实甚猖獗，此将成为今后治安肃清上最大关心之问题。因此，次期讨伐肃清目标之重点，特别集中指向共产军，一心一意加以毁灭。"可见日本侵略军在华北敌后已将八路军作为它的主要对手。
国民党的反共军事摩擦并没有因为在华北遭受惩罚而停止下来。1940年下半年，毛泽东从对国内外局势的分析出发，一再向党内发出警告：要有足够的精神准备应付突然发生的事变，应付最危险最黑暗局面的到来。这种危险果然很快就出现了，那就是国民党当局在1941年1月制造的震惊中外的皖南事变。
皖南事变的发生
蒋介石为什么会选择这个时候发动新的更大规模的反共高潮？这同剧烈变动着的国际形势有关。1940年6月5日，德国对法国发动闪电式的全面进攻。5天后，意大利向英、法正式宣战，欧洲局势急转直下。同月22日，法国贝当政府向德国投降。英军从欧洲大陆退守本土，并遭遇德国空军的猛烈轰炸。9月间，德、意、日三国在柏林签订三国军事同盟条约，英、美间也签订协定，国际上两大集团的对峙和斗争更加剧烈，都想拉蒋介石加入他们的联盟。苏联也仍在继续援助国民党政府。这种局面使蒋介石得意忘形，大大壮了他的胆。周恩来看得很透彻。他在11月1日从重庆致电中共中央说：三国协定后，英积极拉蒋，蒋喜。现在日本拉蒋，蒋更喜。斯大林电蒋，蒋亦喜。此正是蒋大喜之时，蒋现在处于三个阵线争夺之中。他认为以一身暂时兼做戴高乐、贝当、基玛尔，最能左右逢源，时机是紧迫了。只有20天，反共局部战争会开始。
和一年前那次反共高潮不同，蒋介石把这次反共军事行动的重点放在华中。在他看来，华中比华北更接近他原来的统治中心地区，而且八路军在华北早已站稳脚跟，国民党军队在那里兵力单薄，难以对付。而新四军在华中立足未稳，孤悬皖南的新四军军部更处在日军和国民党军队的重围之下，实力悬殊，没有多少回旋余地，较易下手。特别是随着共产党1940年在华中地区的兵力不断增加，10月间，苏北最主要的国民党军韩德勤部竟在黄桥镇被陈毅的新四军一举击溃，华中国共两党军事优劣的对比明显易手，这不能不使蒋介石和多数国民党将领更加坐卧不安了。
10月19日，国民党当局以参谋总长何应钦、副参谋总长白崇禧名义，借口统一军令，致电朱德、彭德怀、叶挺，把他们制造反共摩擦的责任推到八路军和新四军头上。限令八路军、新四军在一个月内全部开赴黄河以北的指定地区，并从已有的50万人缩编到10万人。为配合这一最后通牒式的通告，国民党这时停发了八路军和新四军的军饷。这自然是八路军和新四军无法接受的，也是事实上做不到的。11月9日，朱德、彭德怀、叶挺、项英复电何、白加以驳斥，但表示江南正规部队为顾全大局，遵令北移，请宽以限期。