实验3食品中蛋白质的测定
（GB 5009.5-2010）
3.1凯氏定氮法
3.1.1原理
食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵。碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。
3.1.2试剂和材料
除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的三级水。
（1）硫酸铜（CuSO4·5H2O）。
（2）硫酸钾（K2SO4）。
（3）硫酸（H2SO4 密度为1.84g/L）。
（4）硼酸（H3BO3）。
（5）甲基红指示剂（C15H15N3O2）。
（6）溴甲酚绿指示剂（C21H14Br4O5S）。
（7）亚甲基蓝指示剂（C16H18ClN3S·3H2O）。
（8）氢氧化钠（NaOH）。
（9）95%乙醇（C2H5OH）。
（10）硼酸溶液（20 g/L）：称取20 g硼酸，加水溶解后并稀释至1000 mL。
（11）氢氧化钠溶液（400 g/L）：称取40 g氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至100 mL。
（12）硫酸标准滴定溶液（0.0500 mol/L）或盐酸标准滴定溶液（0.0500 mol/L）。
（13）甲基红乙醇溶液（1 g/L）：称取0.1g甲基红，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100 mL。
（14）亚甲基蓝乙醇溶液（1 g/L）：称取0.1g亚甲基蓝，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100 mL。
（15）溴甲酚绿乙醇溶液（1 g/L）：称取0.1g溴甲酚绿，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100 mL。
（16）混合指示液：2 份甲基红乙醇溶液与1份亚甲基蓝乙醇溶液临用时混合。也可用1份甲基红乙醇溶液与5份溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。
3.1.3仪器和设备
（1）天平：感量为1mg。
（2）定氮蒸馏装置：如下图所示。
（3）自动凯氏定氮仪。
3.1.4分析步骤
3.1.4.1凯氏定氮法
（1）试样处理：称取充分混匀的固体试样0.2～2 g、半固体试样 2～5 g 或液体试样10～25 g（相当于30～40 mg氮），精确至0.001 g，移入干燥的100 mL、250 mL 或500 mL定氮瓶中，加入0.2 g硫酸铜、6 g 硫酸钾及20 mL硫酸，轻摇后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热0.5～1 h。取下放冷，小心加入20 mL水。放冷后，移入100 mL 容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。
（2）测定：按下图装好定氮蒸馏装置，向水蒸气发生器内装水至2/3 处，加入数粒玻璃珠，加甲基红乙醇溶液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生器内的水并保持沸腾。
（3）向接收瓶内加入10.0 mL硼酸溶液及1～2滴混合指示液，并使冷凝管的下端插入液面下，根据试样中氮含量，准确吸取2.0～10.0 mL试样处理液由小玻杯注入反应室，以10 mL水洗涤小玻杯并使之流入反应室内，随后塞紧棒状玻塞。将10.0 mL氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸馏10 min后移动蒸馏液接收瓶，液面离开冷凝管下端，再蒸馏1 min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下蒸馏液接收瓶。以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定至终点，其中2份甲基红乙醇溶液与1份亚甲基蓝乙醇溶液指示剂，颜色由紫红色变成灰色，pH 5.4；1 份甲基红乙醇溶液与5份溴甲酚绿乙醇溶液指示剂，颜色由酒红色变成绿色，pH 5.1。同时作试剂空白。
3.1.4.2自动凯氏定氮仪法
称取固体试样0.2～2 g、半固体试样2～5 g 或液体试样10～25 g（相当于30～40 mg氮），精确至0.001 g。按照仪器说明书的要求进行检测。
3.1.5分析结果的表述
试样中蛋白质的含量按式（3-1）进行计算。
X=(V1-V2)×c×0.0140m×V3/100×F×100（3-1）
式中：X——试样中蛋白质的含量，g/100 g；
V1——试液消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，mL；
V2——试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，mL；
V3——吸取消化液的体积，mL；
c——硫酸或盐酸标准滴定溶液浓度，mol/L；
0.0140——1.0 mL硫酸［c(1/2H2SO4)＝1.000 mol/L］或盐酸［c(HCl)＝1.000 mol/L］标准滴定溶液相当的氮的质量，g；
m——试样的质量，g；
F——氮换算为蛋白质的系数。一般食物为6.25；纯乳与纯乳制品为6.38；面粉为5.70；玉米、高梁为6.24；花生为5.46；大米为5.95；大豆及其粗加工制品为5.71；大豆蛋白制品为6.25；肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵为5.30；复合配方食品为6.25。
以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，蛋白质含量≥1 g/100 g时，结果保留三位有效数字；蛋白质含量＜1 g/100 g时，结果保留两位有效数字。
3.1.6精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10 %。
3.2分光光度法
3.2.1原理
食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，在pH 4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3，5-二乙酰-2，6-二甲基-1，4-二氢化吡啶化合物。在波长400 nm下测定吸光度值，与标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。
3.2.2试剂和材料
除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的三级水。
（1）硫酸铜（CuSO4·5H2O）。
（2）硫酸钾（K2SO4）。
（3）硫酸（H2SO4 密度为1.84 g/L）：优级纯。
（4）氢氧化钠（NaOH）。
（5）对硝基苯酚（C6H5NO3）。
（6）乙酸钠（CH3COONa·3H2O）。
（7）无水乙酸钠（CH3COONa）。
（8）乙酸（CH3COOH）：优级纯。
（9）37%甲醛（HCHO）。
（10）乙酰丙酮（C5H8O2）。
（11）氢氧化钠溶液（300 g/L）：称取30 g 氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至100 mL。