康生历史上就素以性格阴险、整人残酷著称，他善于随机应变，一遇到适宜的政治气候，便以“左”派面目出现，玩弄权术，搞阴谋诡计，兴风作浪，大肆栽赃，陷害忠良。在“文化大革命”中他是诬陷迫害刘少奇的元凶。
1966年4月，以中共中央发出“五·一六”通知为标志，历时10年的“文化大革命”全面爆发。《通知》中的观点完全背离了我国社会的客观实际，错误地估计了党和国家领导干部的现状，混淆了矛盾性质，说明当时逐渐形成的“左”倾错误观点在党内占了主导地位。
1967年7月，江青、康生、陈伯达擅自决定批斗刘少奇，对他进行人身迫害并抄家。江青伙同康生、谢富治擅自成立“刘少奇、王光美专案组”，由江青亲自领导。江青说：“康生有延安整风的经验，他当组长，专案组我要直接抓。”
江青要康生向毛泽东请示建立刘少奇专案组、邓小平专案组、陶铸专案组，毛泽东说，不能立，都是八届十一中全会选的常委。康生随即把毛泽东的话告诉了江青，江青不顾毛泽东的反对，在专案组说：“不能立，也得立，那就放在彭真案里一起整”，“刘少奇、王光美专案组”就这样擅自建立了。
江青、康生为了把刘少奇打成“叛徒、内奸、工贼”，大肆进行逼供、作伪证、造假案。他们先制造了所谓“六十一人叛徒集团案”，本来此案与刘少奇无关，可是江青、康生多次找中央组织部长安子文逼供，要他出伪证，均被安子文拒绝。他们为了逼供取伪证，先后逮捕关押了10多名干部。
康生制造了一个绝顶荒谬的逻辑：“妻子是特务，丈夫一定也是特务。”于是，江青、康生一定要把王光美打成“美国特务”。他们将北京市副市长刘仁等扣上“特务”罪名，作为王光美特务案的“证人”投进监狱，刘仁最后被折磨惨死在狱中。
江青一伙用刑讯逼供编造出来的“口供”，给王光美罗织了“特务”罪名，康生亲自修改《王光美特务问题情况报告》，将“基本可以断定”改为“根据现有材料证明”，王光美不仅是“美国特务”，而且是“日特”、“国特”。按照康生的荒谬逻揖，刘少奇也就成了“美国特务”，而且是美国远东“情报代表”、“特派员”。
刘少奇遭到康生等的残酷迫害，于1969年11月12日逝世。刘少奇是1921年入党的老党员，几十年来一贯忠于党和人民，把毕生精力献给了中国解放和建设事业，建立了不可磨灭的功绩。1980年2月29日，中共十一届五中全会为刘少奇彻底平反，恢复名誉。