5时34分，美军巡逻机在中途岛西北、方位320度、距离180海里处突然发现日军航母舰队；在同一方位、距离150海里处发现大批来袭日军飞机。接到这个紧急报告后，中途岛上几乎所有的飞机于6时以后升空，以免被消灭在地面。升空的美机除战斗机机群迎战来袭日军飞机外，其余飞机主要是鱼雷机群和轰炸机群，分别前去攻击日军航空母舰舰队。从7时05分起，美军飞机分3波连续攻击日军舰队长达1个半小时。但是，由于日军防空炮火猛烈和战斗机的拦截，加上美军飞行员无实战经验，美军飞机未能突破日军防御，所投鱼雷和炸弹无一命中。参加攻击的40架美机被击落15架，受创6架，仅有19架尚能作战。起飞机迎战日机的美国战斗机在距中途岛30海里的空域与日机遭遇，由于日军“零”式战斗机的空战性能远比美机优越，双方交战不久，美机便转攻为守，并想方设法摆脱日军战斗机的穷追猛打。日军机群对中途岛实施了长达30分钟的狂轰滥炸，除飞机跑道完好无损外，地面设施几乎全部被毁。
美日首次交锋的结果，日军占有绝对的优势，日方军舰末受到任何损失，而中途岛上的美军飞机已经损失一半。然而，美军的中途岛岸基航空兵虽然未能狠狠打击日军航空母舰部队，却通过积极进攻有效地牵制了日军半数的空中兵力，对日军航母舰队的侧翼构成威胁，迫使日军在兵力调配和作战指挥上顾此失彼。此战，还使美军确定了日军航母的位置，为下一步突击行动创造了必要条件。
当中途岛派出的侦察机首次报告发现日军航空母舰时，美国航空母舰编队正位于日军航空母舰编队东北方向大约200海里处，在这紧要关头，美军两支航空母舰编队的指挥官弗莱彻将军立刻下令“大黄蜂”号和“企业”号航空母舰“向西南急进，一经查明敌航空母舰位置，立即予以攻击”。“约克城”号则在回收侦察机后随后跟进不得有误，接到命令后，“约克城”号以迅雷不及掩耳之势总向了指定地点。7时许，在估计距日军航空母舰150海里处，第16特遣舰队司令斯普鲁恩斯命令舰载机起飞。7时45分和8时零6分，“企业”号和“大黄蜂”号的117架轰炸机、鱼雷机和战斗机分两批前去攻击日军航空母舰。
8时30分稍过，弗莱彻决定动用“约克城”号上蠢蠢欲动的35架飞机参战。
在此期间，日军南云第1机动部队一直保留半数舰载机，准备随时对付可能出现的美军航空母舰，但始终未发现美军舰的行踪。同时，南云部队又频繁受到中途岛岸基飞机的轰炸，中途岛的第一次空袭没有达到预期效果，谈不上成功。在这种情况下，南云下令，准备攻击美国舰队的日军第二波突击机群立即换掉鱼雷炸弹，改装轰炸陆上目标的炸弹，随机而动，准备再次出击中途岛。7时28分，日军搜索飞机报告，发现10艘美国军舰。但直到8时20分，日机才又报告，其中似有1艘航空母舰。南云在7时45分重新命令部队将炸弹改换鱼雷，准备攻击敌舰队。但是，更换武器延滞了飞机起飞的时间。此外，7时零5分至8时35分，日舰队频频受到中途岛岸基飞机的攻击和美国潜艇的袭击，被迫一再进行规避运动，这不仅妨碍了舰载机的起飞，更使日舰队陷于混乱状态。直到8时30分左右开始回收袭击中途岛后返航的机群时，混乱状态才得以平息。9时18分，最后一架飞机回收后，南云第1机动部队开始北撤，以便整理队形，袭击美国军舰。然而，为时已晚，美军的舰载机已经飞临南云部队的上空。此时的日军也只能目送它们远去：别无选择。
9时23分至10时20分，“大黄蜂”号、“企业”号、“约克城”号的4l架鱼雷机，在没有战斗机掩护的情况下，分3批首先发起进攻，但均被日军战斗机拦截；损失飞机8架，所发射的13枚鱼雷无一命中。美军鱼雷机的攻击虽末见效但却将日军战斗机引向低空，为随后从高空俯冲而下的轰炸机的进攻创造了有利条件。
10时10分，来自“企业”号的轰炸机队飞抵日军航空母舰部队上空。10时24分，25架美军轰炸机茌没有遭到日军战斗机拦截的情况下，对准“加贺”号航空母舰俯冲而下，直接命中4枚炸弹。另5架轰炸机，于10时26分左右轰炸门军“赤城”号航母，命中2弹。10时25分，“约克城”号的17架轰炸机攻击日军“苍龙”号航母，命中3弹。3艘日军航空母舰中弹后即爆炸起火，火苗直冲云霄，光亮刺眼，同时丧失作战能力，随后相继沉没。
这样，日军反击的重担就落在了“飞龙号”1艘航空母舰肩上。10时58分，“飞龙”号起飞轰炸机18架、战斗机6架反击美军航空母舰。12时稍过，日军飞机飞抵.“约克城”号上空，在与美军战斗机激战中实施轰炸，投中3弹，自己损失13架轰炸机和3架战斗机。13时21分，“飞龙”号集中能够使用的全部攻击兵力共10架鱼雷机和6架战斗机，拼死一搏再次起飞攻击美国航空母舰。14时，40分左右，“约克城”号又被2颗鱼雷击中，就在这时，一个诡异的想法划过舰长的脑海。15分钟后，舰长下令弃船（6月6日13时零5分，该航空母舰被日军潜艇击沉）。反击得手的日军很兴奋地误认为已经重创2艘美军航空母舰，企图在薄暮时以“飞龙”号残存的5架轰炸机、4架鱼雷机和10架战斗机，对剩下的1艘美军航空母舰实施第3次攻击。
美军在重创日军3艘航空母舰后，继续忙于寻找第4艘航空母舰。14时30分，美军搜索飞机发现了“飞龙”号，15时30分和16时零3分，美军集中40架轰炸机分两批起飞攻击日舰。16时45分左右，第一批轰炸机背对夕阳接近目标，8分钟后开始攻击，4枚炸弹命中目标，“飞龙”号随即燃起大火（6月5日12时日军发射鱼雷自沉“飞龙”号航空母舰）。美军第二批轰炸机既而转向对口军战列舰、巡洋舰的攻击，收效甚微，美军损失轰炸机5架。
至此，美军击毁了日军第1机动部队的全部航空母舰（4艘）和舰载飞机，取得海上伏击战的决定性胜利，迫使日军放弃对中途岛的进攻。此后，美军为避免与日军夜战，造成不必要的损失，在最后一架飞机被回收后，于19时零7分向东方规避。战斗力急剧锐减的日军第1机动部队担心美军乘胜追击，也向西北方撤退。
四、美军锁定“最上”号和“三隈”号
双方航空母舰主力激战的时候，日军另两支部队正位于远离交战地点的西北和西南方向海域。联合舰队司令山本五十六获悉交战结果之后，决定改变先攻占中途岛、再与美国舰队决战的预定方针，转而采取集中力量消灭美军舰队、尔后再攻占中途岛的新方针。
6月4日12时20分和13时10分，联合舰队下令推迟攻占中途岛和阿留申群岛作战（17时30分，阿留申方面的作战重新恢复），准备对美国舰队实施决战。为此调整了部署：负责攻占中途岛的部队以一部掩护运输船队暂时后撤，另一部（4艘重巡洋舰、2艘驱逐舰）于当晚炮击中途岛航空基地，以消除该岛岸基航空兵的威胁；攻占部队主力（“瑞风”号航空母舰、2艘战列舰、4艘重巡洋舰及其他舰只）即刻北上赶赴海战战场。正在北方阿留申群岛作战的第2机动部队（含“龙骧”号和“隼鹰”号2艘航空母舰、2艘重巡洋舰及其他舰只）迅速南下与第1机动部队残部会合。在基斯卡岛以南枷海里位置担负警戒任务的第1舰队（战列舰队，6月3日与联合舰队主力分离，拥有战列舰4艘、轻巡洋舰2艘及驱逐舰等）立即南返，与山本五十六的主力（含“凤翔”号航空母舰、3艘战列舰、1艘轻巡洋舰、10艘驱逐舰等其他舰只）会合。先遣（潜艇）部队向战场移动。
日军各部队接令后即向海战战场方向运动集结气势壮观。山本判断，美军航空母舰很可能损伤严重，正向东面退避。距美军仅100海里左右的第1机动部队抓住战机迅速追击，北上的攻占部队主力尽可能前来支援作战。通过夜战，有利于捕捉歼灭美国舰队。据此，19时14分，联合舰队下令，追击敌人，实施夜战，恢复攻占中途岛的作战。
第1机动部队指挥官南云坚决反对，他错误地认为，美军舰队尚有4艘航空母舰，而且正在向西追击。因此，第1机动部队放弃了转向东面追击，反而继续向西北方向躲避。以后，虽然任命近藤信竹海军中将（中途岛攻占部队指挥官）统率第1机动部队实施夜战，但是，已经丧失接敌夜战的最佳时机已经丧失。6月5日零时15分至2时55分，联合舰队只好命令各部队取消夜战，停止炮击中途岛，中止对中途岛的攻占，各部队回撤集结。
5日拂晓，中途岛美军高度戒备，向东规避的美国航空母舰特遣舰队也向中途岛疾驶，准备追击日军对中途岛的再次进攻。不久，当美军觉察到日军已放弃进攻正在后撤时，当机立断向四展开迅猛追击。上午8时，美军搜索飞机在中途岛西北发现后撤中的日军第1机动部队。ll时许，中途岛附近的美国航空母舰部队决定实施追击。15时至15时45分，“企业”号和”大黄蜂”号起飞58架轰炸机前去捕捉日军影踪，但由于云层密集，能见度较低气候恶劣，未能发现目标，返航途中发现日军驱逐舰“谷风”号，立即实施攻：没有结果。美军损失1架轰炸机美国航空母舰部队在黑暗中回收飞机后决定，第二天的攻击目标转向中途岛以西的日军重巡洋舰“最上”号和“三隈”号。
6月6日6时许和1l时左右，“企业”号和“大黄蜂”号分别起飞18架和26架轰炸机，9时45分至14时45分期间，美军舰载轰炸机数次攻击“二隈”号、“最上”号及2艘护航驱逐舰，击沉“三隈”号重巡洋舰，击防“最上”号重巡洋舰和“荒潮”号驱逐舰。回收飞机后，美军航空母舰部队考虑到燃料的严重缺乏，人员疲惫不堪，第二天继续迫击会超出中途岛岸基飞机警戒圈外，以及进八威克岛的日军岸基航空兵攻心范围等原因，遂于19时掉头向东航行，果断地结束了追击战，从而粉碎了日军联合舰队引诱美国舰队进入其岸基航空兵攻击圈的企图。
在中途岛战役中，日军损失航空母舰4艘、重巡洋舰l艘，损伤战列舰l艘、重巡洋舰1艘、驱逐舰2艘、油舶1艘，另有2艘驱逐舰相撞受伤，损失各类飞机332架。美军损失航字母舰和驱逐舰各1艘，损失飞机147架。
鉴于损失严重，日军人本营海军部于6月6日决定中止对中途岛的攻占行动。10日决定，推迟预定在7月实施的对莫尔兹比以及对澳大利亚东部的新喀里多尼亚、斐济和萨摩亚各群鸟的进攻战。
在中途岛和阿留群岛战役中，付出沉重代价的日军仅占领了次要方向的2个小岛，整个第二阶段第二期进攻战的主要目标都未如愿以偿，这一结局极大影响了以后太平洋战场的战争进程。日军大本营海军部继6月6日和10日下令中止攻占中途岛、推迟预定7月实施的进攻莫尔兹比和新喀里多尼亚、斐济、萨摩亚各群岛的作战之后，又于7月10日正式取消了上述各项作战。
这意味着美军在太平洋战场上全面遏止了日军的进攻势头，开始扭转太平洋战场上美守日攻的战略态势，巩固了北起阿留申群岛、中经夏威夷群岛、南至澳大利亚的战略前沿，稳固了太平洋战场的战局，使“先欧后亚”战略得以顺利实施，为美军逐渐由防御转入进攻创造了重要条件。