1609年7月，盛传一荷兰眼镜工人发明了供人玩赏的望远镜。他未见到实物，思考竟日后，用风琴管和凸凹透镜各一片制成一具望远镜，倍率为3，后又提高到9。他邀请威尼斯参议员到塔楼顶层用望远镜观看远景，观者无不惊喜万分。参议院随后决定他为帕多瓦大学的终身教授。1610年初，他又将望远镜放大率提高到33，用来观察日月星辰，新发现甚多，如月球表面高低不平，月球与其他行星所发的光都是太阳的反射光，水星有4颗卫星，银河原是无数发光体的总汇，土星有多变的椭圆外形等等，开辟了天文学的新天地。是年3月，出版了他的《星空信使》一书，震撼全欧。随后又发现金星盈亏与大小变化，这对日心说是一强有力的支持。伽利略日后回顾在帕多瓦的18年时，认为这是他一生中工作最开展、精神最舒畅的时期。事实上，这也是他一生中学术成就最多的时期。
托斯卡纳时期20年来伽利略在物理学和天文学研究上的丰硕成果，激起了他学术上的更大企求。为了取得充裕时间致力于科学研究，1610年春，他辞去大学教职，接受托斯卡纳公国大公聘请，担任宫廷首席数学家和哲学家的闲职与比萨大学首席数学教授的荣誉职位。
为了使科学免受教会干预，伽利略曾多次去罗马活动。1611年他第二次去罗马，目的在于赢得宗教、政治与学术界认可他在天文学上的发现。他在罗马受到包括教皇保罗五世和若干高级主教在内的上层人物的热情接待，并被林赛研究院接纳为院士。当时耶稣会的神父们承认他的观测事实，只是不同意他的解释。这年5月，在罗马大学的大会上，几个高职位的神父公开宣布了伽利略的天文学成就。
同年，他观察到太阳黑子及其运动，对比黑子的运动规律和圆运动的投影原理，论证了太阳黑子是在太阳表面上；他还发现了太阳有自转。1613年他发表了3篇讨论太阳黑子问题的通信稿。另外，1612年他又出版了《水中浮体对话集》一书。
1615年，一诡诈的教士集团和教会中许多与伽利略敌对的人联合攻击伽利略为哥白尼学说辩护的论点，控告他违反基督教义。他闻讯后，于是年冬第三次去罗马，力图挽回自己的声誉，企求教廷不因自己保持哥白尼观点而受到惩处，也不公开压制他宣传哥白尼学说，教廷默认了前一要求，但拒绝了后者。教皇保罗五世在1616年下达了著名的“1616年禁令”，禁止他以口头的或文字的形式保持、传授或捍卫日心说。
1624年，他第四次去罗马，希望故友新任教皇乌尔邦八世能够同情并理解他的意愿，以维护新兴科学的生机。他先后谒见6次，力图说明日心说可以与基督教教义相协调，说“圣经是教人如何进天国，而不是教人知道天体是如何运转的”；并且试图以此说服一些大主教，但毫无效果。乌尔邦八世坚持“1616年禁令”不变；只允许他写一部同时介绍日心说和地心说的书，但对两种学说的态度不得有所偏倚，而且都要写成数学假设性的。在这辛勤奔波的一年里，他研制成了一台显微镜，“可将苍蝇放大成母鸡一般。”
此后6年间，他撰写了《关于托勒密和哥白尼两大世界体系对话》一书，1630年他第5次到罗马，取得了此书的“出版许可证”。此书终于在1632年出版了。此书在表面上保持中立，但实际上却为哥白尼体系辩护，并多处对教皇和主教隐含嘲讽，远远超出了仅以数学假设进行讨论的范围。全书笔调诙谐，在意大利文学史上列为文学名著。
教廷的迫害和晚年生活《对话》出版后6个月，罗马教廷便勒令停止出售，认为作者公然违背“1616年禁令”，问题严重，亟待审查。原来有人在教皇乌尔邦八世面前挑拨说伽利略在《对话》中，借头脑简单、思想守旧的辛普利邱之口以教皇惯用辞句，发表了一些可笑的错误言论，使他大为震怒。曾支持他当上教皇的集团激烈地主张要严惩伽利略，而神圣罗马帝国和西班牙王国认为如纵容伽利略会对各国国内的异端思想产生重大影响，提出联合警告。在这些内外压力和挑拨下，教皇便不顾旧交，于这年秋发出了伽利略到罗马宗教裁判所受审的指令。
年近七旬而又体弱多病的伽利略被迫在寒冬季节抱病前往罗马，在严刑威胁下被审讯了三次，根本不容申辩。几经折磨，终于在1633年6月22日在圣玛丽亚修女院的大厅上由10名枢机主教联席宣判，主要罪名是违背“1616年禁令”和圣经教义。伽利略被迫跪在冰冷的石板地上，在教廷已写好的“悔过书”上签字。主审官宣布：判处伽利略终身监禁；《对话》必须焚绝，并且禁止出版或重印他的其他著作。此判决书立即通报整个天主教世界，凡是设有大学的城市均须聚众宣读，借此以一儆百。
伽利略既是勤奋的科学家，又是虔诚的天主教徒，深信科学家的任务是探索自然规律，而教会的职能是管理人们的灵魂，不应互相侵犯。所以他受审之前不想逃脱，受审之时也不公开反抗，而是始终服从教廷的处置。他认为教廷在神学范围之外行使权力极不明智，但只能私下有所不满。显然，G.布鲁诺的被处火刑和T.康帕内拉的被长期打入死牢，这两位意大利杰出的哲学家的遭遇，给他精神上投下了可怕的阴影。宗教裁判所的判决随后又改为在家软禁，指定由他的学生和故友A.皮柯罗米尼大主教在锡耶纳的私宅中看管他，规定禁止会客，每天书写材料均需上缴等。在皮柯罗米尼的精心护理和鼓励下，伽利略重行振作起来，接受皮柯罗米尼的建议继续研究无争议的物理学问题。于是他仍用《对话》中的三个对话人物，以对话体裁，和较朴素的文笔，将他最成熟的科学思想和科研成果撰写成《关于两门新科学的对话与数学证明对话集》。两门新科学是指材料力学（见弹性力学）和动力学。这部书稿1636年就已完成，由于教会禁止出版他的任何著作，他只好托一位威尼斯友人秘密携出国境，1638年在荷兰莱顿出版。
伽利略在皮柯罗米尼家中刚过了5个月，便有人写匿名信向教廷控告皮柯罗米尼厚待伽利略。教廷乃勒令伽利略于当年12月迁往佛罗伦萨附近的阿切特里他自已的故居，由他的大女儿维姬尼亚照料，禁例依旧。她对父亲照料体贴，但4个月后竟先于父亲病故。
伽利略多次要求外出治病，均未获准。1637年双目失明。次年才获准住在其子家中。在这期间探望他的除托斯卡纳大公外，还有英国著名诗人、政论家J.弥尔顿和法国科学家、哲学家P.伽桑迪。他的学生和老友B.卡斯泰里还和他讨论过利用木卫星计算地面经度的问题。这时教廷对他的限制和监视已明显放松了。
1639年夏，伽利略获准接受聪慧好学的18岁青年V.维维亚尼为他的最后一名学生，并可在他身边照料，这位青年使他非常满意。1641年10月卡斯泰里又介绍自己的学生和过去的秘书托里拆利前往陪伴。他们和这位双目失明的老科学家共同讨论如何应用摆的等时性设计机械钟，还讨论过碰撞理论、月球的天平动、大气压下矿井水柱高度等问题，因此，直到临终前他仍在从事科学研究。
伽利略于1642年1月8日病逝，葬仪草率简陋，直到下一世纪，遗骨才迁到家乡的大教堂。