书城自然细胞病理学工作规范及指南
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第22章 细胞病理学诊断工作相关技术指南(4)

第三节 浆膜腔积液细胞病理学检查

浆膜腔积液主要指的是胸、腹、盆腔,心包腔,睾丸鞘膜腔等部位的液体异常增多,积液标本的细胞病理学检查是所有病理科或细胞学实验室的日常工作,是分析、诊断疾病的重要依据。在大多数情况下,伴有积液的疾病通常无外科活检及手术治疗指征,因此积液的细胞病理学诊断便凸显其重要价值,有着活检无法替代的意义。但由于间皮细胞形态的多样性,肿瘤细胞的退行性改变,诊断经验的缺乏及积液制片、染色等不规范,导致浆膜腔积液的细胞病理学诊断停留在非常原始的水平上,而现代诊治学的发展却要求对浆膜腔积液的细胞病理学诊断进行定性、分类甚至分型,因此高质量的制片,规范化的操作程序和诊断水平的不断积累和提高就显得十分迫切。

一、病因及病理生理

(一)浆膜腔积液的主要类型

1.胸膜腔积液:可为单侧或双侧。

2.腹膜腔积液(含盆腔积液)。

3.心包腔积液。

4.睾丸鞘膜腔积液。

5.胸、腹、盆腔,手术野及手术远端管腔冲洗液:虽产生的原因与下述因素无关,但其标本的处理与制片方法同上述标本相同,诊断思路相近,故通常将此类标本与上述标本归为同一类。

(二)浆膜腔积液的病因学

主要包括以下原因:

1.炎症:特异性、非特异性及过敏性炎症。

2.结缔组织病:如风湿病、系统性红斑狼疮等。

3.原发性间皮肿瘤。

4.转移性肿瘤。

5.循环系统疾病。

(三)病理生理学

除人为形成的各类冲洗液标本外,浆膜腔积液形成的病理生理因素如下:

1.血管或淋巴管通透性。

2.浆膜腔负压增加。

3.浆膜毛细血管或淋巴管压增高。

4.血浆胶体渗透压下降。

二、方法学

在浆膜腔积液细胞病理学检查中,细胞成分复杂,类型繁多,形态变异大,人为假象易出现,故诊断难度较大,其细胞病理学诊断建立在优质片子的基础上,细胞涂片的质量好坏直接关系到诊断的成功与否,因此采用正确的标本采集、处理、制片就十分重要。

(一)样本要求

1.样本送检时间应快速,保持样本新鲜,夏天应<1h。若必须存放较长时间,则建议采用以下方法:

(1)50%酒精与浆膜腔积液1∶1混合预固定。

(2)存放在3~5℃冷藏冰箱环境中。

2.标本量除非临床原因,一般应大于100ml,原则上越多越好。

3.适当加入抗凝剂:常加入总量的10%0.106mol/L的枸橼酸钠,混匀后送检。

4.避免交叉污染,用密闭的容器存放及传送。

5.标本必须有标记,且与申请单填写内容一致,同时送到实验室,核对清楚后,有签收记录。

(二)制片

1.离心

(1)标本自然沉淀10~15min后,取瓶底部的液体50~100ml装入两支尖底塑料离心管。

(2)2500~3000r/min,离心5min。

(3)根据沉淀物的性状和数量决定下一步的处理方法。

①量少时,直接倒尽试管内液体,试管竖直倒立在吸水的卫生纸上吸干水分,用吸管直接制片即可。

②量多时:

用吸管吸取上清液弃掉,尽量吸干,然后再吸取沉淀物的上1/3涂片。

同时制成涂片及细胞蜡块。

③血量丰富的样本:吸取上1/3沉淀物放入50%酒精与冰醋酸的混合液中,振荡10min后再第二次离心(800~1000r/min,10~15min),可去除绝大部分红细胞,然后再按上述方法取样。

2.制片

浆膜腔积液的满意制片表现为细胞分布均匀,淋巴细胞、间皮细胞、组织细胞量丰富,多见,形态保存良好,核内结构清晰,无明显肿胀现象,细胞重叠区域少。

其制片方法主要有:

(1)直接涂片。即吸取或用棉棒蘸取沉淀物后直接涂片在玻片中央,单方向进行或用玻片推拉,即一张玻片以5°角左右推拉下方加有样本的载玻片,此制片步骤十分重要。它要求:①推片或涂片尽量均匀一致;②吸出的标本中水分越少越好;③新鲜标本的制片效果远优于加防腐剂或预固定液的陈旧标本。

(2)液基制片。即取得沉淀物后,首先将样本置入细胞保存液中固定,然后再通过不同原理的制片方法将细胞转移到载玻片上,预处理步骤及制片原理同前述。

(3)细胞蜡块制作。若细胞量丰富时,此制片方式可显着提高检查的敏感性与特异性。

在切片上细胞集中,一定程度上保留了原有的组织结构,更有价值的是由于可反复切片,为采用免疫组化、电镜、分子病理学等新技术提供了平台,因此值得推广。具体制作CB的方法见针吸细胞病理学相关章节。

(三)浆膜腔积液的固定

关键步骤是固定时间的把握,其原则:

1.制片完成,尤其是普通涂片完成后应做干燥处理,一般是在涂片边缘区域出现灰白干燥缘时立即固定(切记不能完全干燥后固定),液基薄片则因为已做吸附处理可立即固定。

(注:也有部分学者主张制片后立即固定,但显然脱片是不可完全避免的,此时要注意避免在固定缸内交叉感染)。

2.固定液常用85%酒精,也可用甲醇、乙醚酒精、Cannoy氏固定液等,效果无显着差异。

3.固定时间建议不少于30min。

(四)染色

1.常规染色。常用H.E染色和巴氏染色,具体见相关章节。

2.特殊染色。在临床应用的主要是:

(1)过碘酸Schiff染色(PAS染色):可显示糖原存在与否。

(2)抗酸染色:对疑为结核性炎时用来查找抗酸杆菌。

(3)非特异性酯酶显示法(ANAE):组织细胞显示酸性红褐色颗粒,核绿色,而间皮细胞、肿瘤细胞不着色。

3.免疫细胞化学染色。随着制片技术的持续改进,细胞蜡块技术的推广应用和免疫组化染色技术的提高使免疫细胞化学染色在细胞病理学中的应用越来越广泛,使细胞病理学诊断更准确,敏感度、特异度更高,在浆膜腔积液中的应用也已有许多成熟的经验。

(1)标本的处理。用作免疫细胞化学染色的细胞学标本须注意以下方面:

①采用涂有多聚赖氨酸或APES处理过的玻片须净化或用涂胶片防脱处理。

②涂片面积最好<2cm2,大体积的液基薄片可一分为二使用,CB作免疫组化则是最佳选择。

③固定液以85%酒精为最佳,潮干后尽快固定。

④不能及时染色可置于4~8℃冰箱中(连固定缸)。

(2)染色程序。类似于组织切片,推荐使用非生物素检测系统,详见有关章节。

(3)常用抗体。

①间皮细胞:Cal,Mes,CK5/6,CK7.8/8.18,CR,Des,WF1等。

②上皮细胞抗体:EMA,CEA,CA18‐8,TAG‐72等。

a.在推断原发部位时可用:肝癌——Hep,AFP;肺癌——TTF1,SPA;消化道癌——CA18‐8;前列腺癌——PSA;卵巢肿瘤——CA125等。

b.推断类型时可用:类癌等神经内分泌癌——CgA,Syn;恶性黑色素瘤——S‐100,HMB‐45,Melanin‐A;非霍奇金淋巴瘤——CD45RO,CD3,CD82,CD20,LCA等。

(五)分子病理学技术应用

在浆膜腔细胞病理学检查的辅助技术中,分子病理学技术的参与使其诊断的临床价值越显突出,虽然目前在省内应用尚不多见,但前景值得期待。这些技术包括:

1.原位杂交技术(包括CISH、FISH)及PCR技术。检测端粒或端粒酶,P16基因甲基化,EGFR相关基因,P53基因等。

2.基因重排技术。

3.流式细胞仪技术等。

(六)电镜技术的应用

虽然目前临床应用电镜技术辅助诊断浆膜腔积液细胞病理学涂片尚不多见,但其价值不可否认。

1.标本要求

(1)需戊二醛(4%)和锇酸(1%)先后固定。

(2)塑料或专用配方包埋后超薄切片。

(3)铅铀电子染色。

(4)透视或扫描电镜观察超微结构并摄片。

2.应用价值

(1)间皮或上皮来源的鉴别:间皮细胞特有的细、密、长的微小绒毛相对于腺癌细胞的稀、短、粗具有重要的鉴别意义。

(2)肿瘤类型及其起源的确认。

(3)特殊结构与细胞器的认定。

三、细胞病理学诊断

(一)诊断资料的收集

1.必须详细了解的临床资料:症状、体征、既往史、相关影像学检查结果、生化结果、既往病检资料等。

2.镜下细胞形态的详细观察描述。

(1)一般记录:中性粒细胞(有、无、数量);间皮细胞(数量、形态、分布);组织细胞(数量、形态、分布、吞噬反应活跃度);淋巴细胞(有、无、数量);多核巨细胞及上皮样细胞(有、无、数量);坏死碎片;核分裂像(有、无、何种类型细胞);恶性肿瘤细胞(有、无、数量、形态描述、类型推断)。

(2)染色结果及记录。

(3)免疫组化结果及记录。

(4)其他辅助检查手段。

(二)描述性诊断术语及形态学标准

同痰液、消化道等部位的细胞病理学检查一样,目前浆膜腔积液的细胞病理学诊断也尚未有统一标准的诊断术语及形态学标准,结合省内实际情况,推荐使用以下诊断用语及标准,以供参考。

1.良性改变的各类细胞,未见肿瘤细胞:在制作的涂片标本满意的基础上作出上述描述性诊断,此类别中需分别描述下列各种表现(若存在),如间皮细胞正常形态或良性改变,淋巴细胞、组织细胞数量一般分散,未见其他上皮性细胞或恶性肿瘤细胞等。

(1)间皮细胞形态正常:包括三种形态学类型。

①小细胞型:圆或卵圆形,似基底细胞样。

②上皮型:胞浆相对丰富,均质,核居中,染色质呈细颗粒状。

③梭形细胞型:短梭形或纤维样,胞浆两端或多端有突起,且相互间常以突起相连接。

(2)间皮细胞的良性改变。主要有:

①肿胀变性:由于浆膜腔内脱落的间皮细胞长时间浸泡于胸腹水中,在渗入与吮入作用下,使细胞体积肿胀并发生相应的一系列变化,称为“肿胀变性”。间皮细胞脱落后,由于细胞膜渗透压的改变,细胞质内开始发生液化变性,即增大的细胞内出现一个或多个液化空泡,这些空泡使间皮细胞变为印戒样间皮细胞或泡沫样间皮细胞。这种变化为一种浆液性空泡而非黏液样或分泌性空泡。认识这种变化对鉴别间皮瘤细胞与腺癌细胞有帮助。间皮细胞或间皮瘤细胞胞质中的空泡多发生在离细胞膜很近的位置,胞浆多不嗜色,细胞膜趋向模糊;而腺癌细胞的胞浆着色明显,胞浆内的空泡多为黏液性或分泌性物质,细胞膜清晰。

②固缩变性:在浆膜腔积液中间皮细胞很少发生固缩变性,但可见到。间皮细胞在退变时所发生的细胞体积变小、核亦变小的间皮细胞称“固缩变性”。固缩变性一般出现在梭形间皮细胞中,其核固缩是固缩变性的最重要表现:核缩小,较正常小,有时可出现因核固缩而形成的“核周晕”,核形不规则或畸形,核染质致密浓染,形成黑炭状核。有些细胞的核甚至出现核碎裂或核崩解,在胞浆中出现数个核碎片,此时应注意不要误以为核分裂。

③假性细胞团现象:是由肿胀变性的间皮细胞相互紧贴契合形成,极易误认为癌,其缺乏三维立体结构,细胞形态与普通肿胀变性的间皮细胞差异小。

④增生:正常情况下间皮细胞很少脱落,而在炎症、肿瘤等刺激下,细胞呈增生状态,其数量异常地增多,出现在浆膜腔渗出性积液的细胞亦增多。大多数由各种原因所引起的间皮细胞退化变性的,均为成熟的间皮细胞,即分化良好的细胞。但是可见到潜在的分化形态踪迹,即细胞呈小圆形或类圆形细胞、梭形细胞或其过渡型细胞(印戒细胞)。部分间皮细胞分化成熟,病变中所见到的大多数为成熟型细胞。而这些小圆形未分化或分化不全形态的细胞亦可少量混存其间,上述改变与因外力所获得的正常间皮细胞、间皮细胞异型增生和恶性间皮瘤的间皮细胞不同,分化成熟是退变间皮细胞的特点,因此利用这个特点可鉴别其与上述正常和肿瘤性间皮细胞之间的不同是至关重要的。而混存的未分化及其中间形态细胞,则可被用来与转移性癌的鉴别。

⑤核分裂像:细胞体积多较小,常与良性的间皮细胞相连接,细丝状的DNA清晰、量少。

(3)见多量中性粒细胞及其他炎症细胞,间皮细胞少,未见其他上皮细胞或恶性肿瘤细胞:提示炎症性病变可能。

(4)多量淋巴细胞。

(5)坏死或其他改变。

(6)大量嗜酸性粒细胞。

2.非典型间皮细胞:非典型并不代表确认为恶性,仅表示其与正常细胞形态学上的差别。间皮细胞非典型包括间皮细胞的核增大、核深染和核畸形;非典型的核分裂像;胞质显厚并发生嗜酸性变;多核间皮细胞显着减少;间皮细胞边缘突起;胞质由于核增大而减少;间皮细胞聚团倾向及类型发生变化。描述性术语包括以下几类:

(1)非典型间皮细胞,倾向于良性改变。发现有非典型间皮细胞,但不是恶性细胞,这类细胞可以是前面所描述过的形态学表现。

(2)非典型间皮细胞,但意义不明确。发现非典型间皮细胞,但因以下情况而不能确定其意义:①因退化变性而造成的非典型细胞;②因固定不及时而造成干式固定后的染色效果;③因细胞数量少而不能判断其意义;④不明原因造成细胞变异等。

(3)非典型间皮细胞,潜在意义上的间皮瘤可能,建议活组织检查。主要指间皮瘤的细胞分化好或恶性特点不太明显,而其他指标倾向于间皮肿瘤者。