第13章 病原学、免疫学及生化检测 (4)
②待测血清和对照血清用PBS作1∶10稀释，滴加于抗原片上，放湿盒内，37℃温育30分钟。
③取出抗原片，用流水冲去未结合的血清，置PBS中浸洗，每缸5分钟，吹干。
④滴加稀释的FITC-抗人IgG抗体，置湿盒内，37℃温育30分钟。
⑤同步骤③浸洗，吹干。
⑥滴加缓冲甘油封片，用荧光显微镜检查。
（3）结果判定
①细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞，不发荧光为阴性。抗原片中出现阳性染色细胞为ANA阳性，否则为阴性。阳性待检血清可作进一步稀释后测定效价。
②根据细胞核着染荧光的图象，可区分为均质型，细胞核呈均匀一致的荧光；周边型，细胞核周围呈现荧光；斑点型，细胞核内呈现斑点状荧光；核仁型，核仁部分呈现荧光；混合型，2种以上核染色；应用HEP-2细胞做抗原片可检出着丝点型。
（4）质量控制
①抗原片需保存在2～8℃，如放置于－30℃可保存更长时间。
②抗原片从冰箱取出后应立即吹干。
③待测血清应新鲜，或放－20℃保存。阳性血清置4℃保存1周后，效价降低。
④判定结果时，各实验室需在自己的实验条件下，进行一定数量的正常人调查，确定出正常人血清ANA水平的上限。
⑤免疫荧光检测均需设对照。在间接法中应设阴阳对照、缓冲液和标记抗体对照、无关抗原对照及两个特异性对照。玻片应及时镜检或可放在暗处1～2小时。对于直接法，利用已知的同种和异种抗原作为特异性的试验也是很重要的。
7.免疫酶技术（免疫酶技术中酶联免疫吸附试验应用得最为广泛，以此为例）
（1）原理：酶联免疫吸附试验（ELISA）的基本原理，一是使抗原或抗体结合到某种固相载体表面并保持其免疫活性；二是使抗原或抗体与某种酶（如辣根过氧化酶）联结成酶标记复合物，并保持其免疫活性和酶的活性；三是抗原抗体反应通过检测酶所分解的底物来定性或定量未知抗体或抗原。
（2）操作方法
①一步法，取出试剂盒平衡至室温，将待测样品加入酶标板中，同时加入阴性、阳性对照，空白对照及外控，然后加入适当的酶，按试剂盒要求放置相应的温度与时间孵育，洗涤后加入底物显色液，孵育，加终止液，比色判定结果。
②两步法，取出试剂盒平衡至室温，将待测样品加入酶标板中，同时加入阴性、阳性对照，空白对照及外控，按试剂盒要求放置相应的温度与时间孵育，洗涤，然后加入适当的酶，孵育，洗涤后加入底物显色液，孵育，加终止液，比色判定结果。
（3）结果判定：ELISA结果的判定方法很多，常用的有以下几种。
①目视比色法。在ELISA试验完成后，直接以肉眼观察反应产物的颜色变化，明显显色者判阳性，否则判阴性。
②光电比色法。用分光光度计在适宜的波长下测定反应后的OD值。用酶标仪判定结果需要有界值，判定界值的确定原则有：以阴性对照的2.1倍为界值，此法的思想是认为阴性标本的2.1倍处的OD值是线性的中间点，此点比较敏感和稳定；以（阳性+阴性）／2为界值，此法的思想是认为在阳性OD值的50％处的变化为敏感和稳定；先确定未感染群体的绝对值平均值（X），然后在此水平上选择一个指示感染值（一般是X＋2S），此法的思想是测定值高于X＋2S，说明肯定不是零值。具体选用何种界值，按试剂盒的说明书选择，并按其方法判定阴性、阳性。
（4）质量控制
①酶标仪需要经过计量部门检定，每年检定1次。
②试剂必须是经国家食品药品监督管理局注册批准，批检合格，临床评估质量优良，并在效期内使用。
③每次试验时除了有试剂规定的阴阳对照，试剂空白外，还要有外部对照。对照出控时，应分析原因重新试验。
④静脉采血时注意消毒，采够所需血量，止血带的使用时间不要超过1分钟。及时分离血清，不能及时检测的需冷藏，2～8℃可储存1周，长期保存的应于－20℃或更低温度条件，避免反复冻融。
⑤一份血样有多个检测项目时注意血清样品的保留及编号。试验前将样品及试剂室温平衡30分钟以上，冷冻样品实验前需混匀。
第二节 卫生微生物
一、食品的微生物检测
（一）基本理论
1.食品中常见的细菌
食品中营养丰富易于微生物的生长，无论来自动物性原料的食品还是来自植物性原料的食品自身都有一定的微生物。在食品的流转过程中还会遭受微生物的污染，因此在一定条件下食品会变质成为不符合卫生要求的食品。食品的变质可分为腐败和酸败。腐败是指食品中的蛋白质被微生物的分解引起的变质败坏。酸败是指食品中的脂肪或碳水化合物被微生物的分解引起的变质败坏。无论腐败或酸败均导致食品色、香、味的明显改变。
（1）按其分解能力和分解后引起食品的变化可分为4类
①分解蛋白质的细菌，对蛋白质的分解能力不同菌属也不同，其中分解能力较强的有芽孢杆菌属、假单胞菌属、变形杆菌属和梭菌属。分解较弱的有小球菌属、葡萄球菌属、八叠球菌属、无色杆菌属、产气杆菌属、黄色杆菌属、埃希菌属、沙雷菌属、短杆菌属。此外，粪肠球菌、液化链球菌也能分解酪蛋白，某些真菌也能分解蛋白质。
②分解脂肪的细菌，常见的有荧光假单胞菌、无色杆菌属、产碱杆菌属、沙雷菌属、小球菌属、及少数芽孢杆菌。
③分解糖的细菌，大多数细菌都有分解单糖、双糖的能力。能分解多糖的细菌主要有：枯草芽孢杆菌、马铃薯芽孢杆菌、丁酸梭菌、淀粉梭菌和嗜热解糖梭菌。
④引起食品颜色改变的细菌，产黄色系颜色的细菌有小球菌、葡萄球菌属、黄杆菌属、芽孢杆菌属、荧光假单胞菌、玉米丙酸杆菌、红色丙酸杆菌和八叠球菌等。产粉红及红色系颜色的细菌有黏质沙雷菌、藤黄八叠球菌、凝结芽孢杆菌、坚实芽孢杆菌、假单胞菌、玫瑰小球菌等。产褐色系颜色的细菌主要有致黑假单胞、枯草芽孢杆菌、荧光假单胞菌。产黑色系颜色的细菌有变形杆菌属、致黑梭菌及某些假单胞菌。粪蓝假单胞菌、蓝黑色杆菌使食品变蓝色或蓝绿色。
（2）引起食物中毒的细菌，按其致病的类型分为4型
①引起毒素型食物中毒的细菌，包括肠毒素型和神经毒素型细菌。产肠毒素型的细菌主要有副溶血性弧菌、产肠毒素大肠埃希菌、蜡样芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、志贺菌、霍乱弧菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌等。产神经毒素型的细菌有肉毒梭菌、米酵酸菌。
②引起感染型食物中毒的细菌，主要有沙门菌属、变形杆菌属、肠球菌属以及小肠结肠炎耶尔森菌、空肠弯曲菌、嗜水气单胞菌及某些非O1群弧菌。
2.食品中常见的真菌
食品中含有适合真菌生长的必要条件，在食品的生长、加工、运输和销售环节中均可遭受真菌的污染，根据其主要特性的不同分为真菌和酵母菌，分述如下：
（1）食品中常见的真菌
①毛霉菌属，毛霉菌常造成水果、蔬菜、肉类、糕点、乳制品和果酱等食品的腐败。
②青霉菌属，主要有岛青霉菌、红色青霉菌、扩张青霉菌、枯青霉菌及展开青霉菌，可引起食物中毒。
③根霉菌属，引起粮食及制品霉变。
④曲霉菌属，其中的黄曲霉菌、杂色曲菌、构巢曲菌及寄生曲菌可引起多种食品的霉变。
⑤木霉菌属，可造成谷物、水果、蔬菜的霉变。
⑥交链孢霉菌属，主要引起水果和蔬菜食品变质。
⑦葡萄孢菌属，主要引起水果变质。
⑧芽枝霉菌属，主要引起食品霉变。
⑨镰刀霉菌属，主要引起谷物、水果和蔬菜变质。
⑩地霉菌属，主要引起水果和蔬菜霉变。
（2）食品中常见的酵母菌
①酵母菌属，大部分用于工业生产，但也可引起食品变质。如啤酒酵母可引起水果发酵，鲁氏酵母、蜂蜜酵母引起高糖食品变质及酱油变坏。
②毕赤酵母菌，使酒类和酱油变质并形成浮膜。
③汉逊酵母菌属，引起含糖食品变质。
④赤酵母属，引起食品赤色斑点。
⑤球拟酵母，引起果汁、乳制品、鱼贝类变质。
⑥丝孢酵母，常在酿造食品及冷藏食品中查见。
（3）引起食物中毒的真菌，据其产生的毒素分为2大类：
①据其作用的靶组织分为肝脏毒素，主要引起中毒性肝炎和肝癌，常见的有黄曲霉菌、杂色曲霉菌、棕曲霉菌、岛青霉菌等；神经毒素，黄绿青霉素、展青霉素；肾脏毒素，黄曲霉素、枯青霉素；还有心脏毒素、造血器官毒素等。
②据其化学性质和结构分为生物碱、蒽醌、丁烯酸内酯、香豆素和环氨肽等。
（二）基本知识
1.食品中常规微生物指标 菌落总数、大肠菌群、真菌和酵母计数。
2.菌落总数
食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分、pH、需氧性质等），所得1ml（g）检样中所含菌落的总数。只包括一群在营养琼脂上生长发育的嗜中温性需氧的菌落总数。菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。
3.大肠菌群
一群能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
4.样品的采集
（1）样品种类：可分为大样、中样、小样3种。大样系指一整批，中样是从样品各部分取得的混合样品，小样系指做分析用的检样。定型包装及散装食品均采样250g。
（2）采样方法：采样必须在无菌操作下进行，根据样品种类，袋装、瓶装和罐装食品，应采完整的未开封的样品。如果样品很大，则需用无菌采样器取样；固体粉末样品，应边取边混合；液体样品通过振摇混匀；冷冻食品应保持冷冻状态（可放在冰内、冰箱的冰盒内或低温冰箱内保存），非冷冻食品需在0～5℃中保存。
5.工作流程
接样→查看包装是否完整、采样数量是否符合要求→核对标签与送样单信息是否符合→所检项目是否符合卫生标准要求→核对提供的检测依据是否具备检测能力→样品按保存要求保存→积极准备条件进行检验→检验完的样品放入专用冰箱存放→规定的时间内出具结果→阴性样品及时处理，阳性样品发出报告后3天方可处理。
（三）基本技能
1.样品处理
（1）固体样品：无菌操作采取不同部位称取25g检样，加入灭菌生理盐水225ml中，制成混悬液。
（2）液体样品：外包装擦拭灭菌后，吸取25ml检样，加入灭菌生理盐水225ml中，制成混悬液。（注：冰棍、冰淇淋放在灭菌容器内，融化后立即检验）
（3）特殊样品
①配有调味料的方便面。用无菌操作开封取样，将面块和全部调料及配料一起称量，按1∶1加入灭菌生理盐水，制成检样匀质液，称取50g匀质液加至200ml灭菌生理盐水中，制成1∶10稀释液。
②速冻预包装面米制品。用无菌操作开封取样，称取样品50g，加入灭菌生理盐水225ml中，置45℃水浴30分钟，化冻后立即进行检验。
③带壳干果食品、烘炒食品。用无菌操作开封取样，外壳消毒后无菌操作取出果肉，称取25g检样，加入灭菌生理盐水225ml中，制成混悬液。
2.操作步骤及结果报告
将上述处理后的样品充分振摇或研磨制成1∶10的均匀稀释液，真菌和酵母计数检测将样品加入灭菌水中，振摇30分钟制成1∶10的均匀稀释液。
（1）菌落总数
①操作步骤。根据食品卫生标准要求，选择2～3个适宜稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，吸取1ml样品稀释液于灭菌培养皿内，每个稀释度做2个培养皿，将营养琼脂（46℃）注入平皿摇匀，同时将营养琼脂倾入加有1ml稀释液灭菌培养皿作空白对照，待凝固后，翻转平板，置36℃±1℃温箱内培养48小时±2小时后观察结果。