第13章 病原学、免疫学及生化检测 (2)
操作方法及结果观察：是将分纯的待检细菌，接种到糖（醇）发酵培养基中，置37℃孵箱内，培养数小时到2周，观察结果。若使用微量发酵或要求培养时间较长时，应保持孵箱中一定的湿度，以免培养干燥，被检细菌不生长。被检细菌若能发酵培养基中的糖（醇）时，则产酸培养基的pH降低。这时培养基中的指示剂呈酸色反应，若发酵培养基中的糖（醇）产酸、产气，则培养基不仅显酸色反应，并且有气体出现。培养基若系半固体，则将培养基冲破并含有气泡。培养基若为液体，可看到在培养基中的倒置小玻管中有气体，并且气体占整个倒置小玻管的10％以上，若被检细菌不分解培养基中的糖（醇），则培养基不发生变化。
注意事项：糖发酵试验培养基大致可分为液体、半固体、固体（高层、斜面）等几类，可根据试验的要求和细菌的特性选用不同的培养基。糖发酵试验应用的糖种类很多，归纳起来主要有单糖、双糖、多糖、醇、糖苷等。糖发酵管中应用的指示剂最常用的有酚红、溴草酚兰、溴甲酚紫和酸性复红等。
4.血清学试验
许多抗原抗体在适宜的条件下能在体外试管内发生特异反应，故可用于抗原抗体的检测，因抗体主要存在于血清中，试验时一般均要应用血清，所以体外的抗原抗体反应常称为血清学试验或血清学反应。
（1）基本特性
①高度特异性。此类反应是由于抗原决定簇与抗体结合部位之间的物理化学特性相对应而相互结合的，故有特异性。
②高度敏感性。检测限可达到纳克（ng）级甚至皮克（pg）级，其中以放免测定的敏感性最高，较差的是凝集反应和各种沉淀反应。
③合适比例。当抗原抗体的量比例合适时出现明显的反应，且反应速度快；不合适的比例即不出现反应，属于抑制带。
④可逆性。抗原与抗体的结合是分子表面的结合，是非共价键的结合，这种结合虽相当牢固，但在一定条件下两者可以解离，如在复合物中加入酸、碱、过高的温度等。
⑤反应过程的二阶段性。第一阶段为抗原抗体的特异性结合，需时很短，但无可见现象。第二阶段形成可见反应，需时较长，从数分钟到数小时不等。
（2）影响因素
①温度。合适的温度可加快反应，特别是第二阶段受温度影响较大，一般以15～40℃为宜，37℃最适宜。
②电解质。抗原抗体结合可不需要电解质，但复合物的相互凝聚出现可见反应则需要电解质的存在。
③pH可影响反应的电离和电荷性质，血清反应最适pH为6～8。
④振摇和搅拌可加速反应物的相互碰撞和接触，从而增快形成可见反应的速度。
（3）反应类型：实验室采用的血清学试验方法很多，在此仅叙述其基本类型及基本原理。
①凝集反应。细菌等颗粒性抗原加入相应抗体在适量电解质存在下，发生特异性反应，形成肉眼可见的凝集小块，称为凝集反应。可分为直接凝集反应和间接凝集反应2大类。直接凝集反应指颗粒抗原直接与相应抗体结合而出现肉眼可见的凝集小块，具体有玻片法和试管法。玻片凝集反应为定性反应，方法简便快速，常用于细菌的鉴定与分型。试管凝集反应为定量反应，主要用于检测受试者血清中有无某种特异性抗体及其相对含量。间接凝集反应是将可溶性抗原或抗体吸附于一种与免疫无关的一定大小的微粒上，使成致敏微球，然后与相应的抗体或抗原作用所发生的凝集。微球应用最多的是人O型红细胞及羊红细胞，故又称间接血凝，依据检测抗原抗体的不同可分为正向间接血凝试验、反向间接血凝试验及间接血凝抑制试验。协同凝集反应实际上是间接凝集的一种类型，只是微球是含有SPA的金黄色葡萄球菌。
②沉淀反应。可溶性抗原（细菌培养物的滤液、浸出液等）与相应抗体结合，在有电解质存在的条件下，形成可见的沉淀物，称为沉淀反应。其反应机理与凝集反应基本相同，不同点是凝集反应的抗原是比较大的颗粒性物质、分子大，沉淀反应是比较小的可溶性物质、分子小；凝集反应的凝集块主要由抗原物质形成，沉淀反应的沉淀物主要由抗体蛋白形成；沉淀反应的试验方法有环状法、絮状法和琼脂扩散法3种基本类型。
③补体结合反应。是一种在补体参与下，以绵羊红细胞和溶血素为指示系统的抗原抗体反应，本法可用于未知抗原抗体的测定，多用于检测某些病毒、立克次体和螺旋体病病人血清中的抗体。
④免疫标记技术。是用荧光色素、酶或放射性同位素对抗体或抗原进行标记，并使其标记后不影响抗体或抗原活性，以此标记物进行抗原抗体反应，并通过对标记物的检测来判定结果。因此具有很高的敏感性。常用的有免疫荧光法、免疫酶技术和同位素标记等类型，其中又以免疫酶中酶联免疫吸附试验应用得最为广泛。
酶联免疫吸附试验（ELISA）的基本原理，一是使抗原或抗体结合到某种固相载体表面并保持其免疫活性。二是使抗原或抗体与某种酶（如辣根过氧化酶）联结成酶标记复合物，并保持其免疫活性和酶的活性。三是抗原抗体反应通过检测酶所分解的底物来定性或定量未知抗体或抗原。由于酶的催化效率很高，可极大地放大反应结果，故此法具有极高的灵敏度。ELISA的具体方法有许多种，但基本类型有间接法、夹心法和竞争法等。基本操作步骤有包被、加样、加酶结合物、显色及中止。
5.质量控制
细菌检验是质量控制，是保证细菌的直接涂片、培养、药敏及血清学试验的准确性，细菌检验主要是定性试验，以手工操作为主加上主观的解释，因此变数较大，必须控制这些因素使检验保持在稳定的水平。
（1）检验人员的水平及培训
（2）仪器设备使用和运行过程中的检查和校准
①高压灭菌器和干热灭菌器。每年对其温度计及压力表由计量部门进行校验1次，确保其测量值的可靠和有效；平时使用时要对其温度及灭菌时间进行监控和记录，并要使用化学或生物指示剂进行灭菌效果监控，每月进行1次嗜热脂肪芽孢杆菌灭菌效果观察。
②培养箱、水浴箱及冰箱。每年对其温度计由计量部门进行校验1次，注意示值及控温范围的准确性。每天于工作开始前和结束后对温度进行观察并记录。
③其他设备如二氧化碳培养箱、厌氧培养箱等也应当用适当的办法来进行效果监控。
（3）培养基的质量控制：目前，大多数实验室均使用成品干粉培养基，质量一般比较稳定，但新购回在投入使用前必须对其进行主要技术指标的符合性验收，只有在支持生长及抑制生长等指标符合技术要求时才可投入使用。具体方法可参照本章第二节第六部分。在培养基的配制方面要做好以下工作。
①配制记录。内容包括培养基名称、配制量、配制日期、有效期、灭菌温度、时间及压力、灭菌效果指示、配制者等。
②外观检查。观察其颜色及透明度有无异常。
③无菌试验。培养基在配制灭菌完投入使用前（有时可同时进行），可随机抽取几管或几块平板置37℃培养24小时，无菌生长者视为合格。
实验中用到的其他试剂、染色液及诊断血清等注意按规定要求保存、有效期内使用、用标准菌株作验证。
（4）方法：应用国家标准方法、规范及经过实验验证的杂志文献推荐的方法，并根据实际情况编制成作业指导书或操作规程。
（5）记录：对一些可能影响检测质量的环境因素如气温、气压、湿度等按要求加以控制并做好记录。
6.病原菌的快速检测
病原学快速检测是应对公共卫生事件的关键技术，一般采用免疫学、分子生物学、生物化学等实验手段，项目包括病原微生物特异性抗原、特异代谢产物、特异基因、特异性抗体或其他感染性标志物的测定。检测时间一般为几分钟至几小时，作为初筛试验，检测结果需经进一步实验确认。
（1）免疫学方面的快速检测原理：同前面所述的血清学试验，只是在时间上更快捷，如免疫胶体金技术，就是用已知抗原或抗体包被硝酸纤维素膜，再用金标记抗体或抗原来进行快速测定，阳性时呈胶体金的红色，半小时内可作出初步诊断。基于抗原抗体反应而衍生出快速检测技术很多，各实验室可根据需要选择合适的方法加以应用。
（2）微量生化反应系统：通常由10～30个生化指标组合而成，通过对结果的判断，得出1个由3～7位数组成的数字，查阅编码手册即获得相应细菌的名称，如与计算机联合使用可更快捷。由于采用微量生化管或微量测试卡，观察结果的时间可由传统的24小时缩短到4～6小时。如API测试卡、VITEK微生物鉴定系统等。具体步骤有：样品制备、加样、孵育、判读结果。样品制备：将待鉴定的细菌划线接种于营养琼脂，37℃孵育18～24小时，刮取菌苔于无菌生理盐水中制成一定浓度悬液备用。加样：无菌操作将一定量的菌悬液加入微孔板或测试卡，加盖置37℃孵育18～24小时（快速板为4～6小时）。判读结果：取出测试卡，观察并记录各反应孔结果，查找编码手册得出相应结果，也可直接通过鉴定仪读取结果。注意事项：菌种的纯培养要用无抑制性培养基，以利菌种的全面发育。菌液的浓度要按测试卡说明书进行准备，不得太浓也不能太稀。
（3）分子生物学通过检测特异性核酸来鉴定微生物
①PCR技术。聚合酶链反应是一种DNA体外扩增技术，它可以在几个小时内将极微量的目的基因或DNA片段数目放大几百万倍，故具有高敏感性。这项技术的主要条件是设计一对引物，它所介导的扩增序列必须符合以下要求：一是该生物所独有，只有这样才能保证检测结果的特异性；二是为该微生物DNA的保守序列，以免因基因的变异造成漏检。近年来，随着荧光实时定量PCR的发明，扩增和产物检测同时完成，加上试剂的高度商品化，这项工作已非常简单快捷，已广泛应用于临床和公共卫生突发事件的病因调查并取得很好的效果。具体步骤有核酸提取、加样、扩增及结果分析。核酸提取：分为手工法及仪器法，可根据操作说明书进行。加样：根据具体情况加入一定量的样品、反应液、酶。扩增：将加有反应体系的微孔板放入仪器进行扩增并同时采集数据（由仪器自动完成）。结果分析：确定Ct值，并据此判断被检标本中是否有目标基因，通过标准曲线计算原始标本中的起始拷贝数。
②生物芯片技术。是通过微加工技术和微电子技术在固体芯片上构建的微型生物化学分析系统。它是微电子学、生物学、免疫学、物理学、化学和计算机学为一体的高度交叉的新技术。其特点是高通量、微型化和自动化地实现对细胞、蛋白质、基因及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。其原理是将大量生物分子（DNA、RNA、抗体、酶、蛋白质等）作为探针固定于支持物表面，且每一种分子或几种分子探针的组合代表一种病原体或疾病，经与样品中相应分子特异配对或结合而达到检测的目的。根据其固定的生物分子及材料不同，可分为基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片等，基因芯片是将大量的基因探针分子固定在固体芯片表面，然后与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号的强度，进而获得靶分子的信息，可同时、快速、准确地分析数以千万计的基因信息。蛋白质芯片是利用抗原与抗体、受体与配体特异性结合的反应来构建的分析系统。将制备好的蛋白质（抗原或抗体）固定于经化学修饰的玻片、硅片或滤膜等载体上，然后加入与之特异结合的带有特殊标记的蛋白质分子，通过对标记物（同位素、酶、化学发光物质等）的检测，即可获得生物体中蛋白质的信息。
（倪雨中）
二、血清学试验
（一）基本理论
许多抗原和抗体在适宜条件下，能在体外试管内发生特异反应，故可用已知抗体检测待测抗原，也可用已知抗原检测待测抗体。因抗体主要存在于血清中，试验时一般均要应用血清，所以体外的抗原抗体反应常称为血清学试验或血清学反应。通常有沉淀试验、凝集试验、补体结合试验、免疫荧光技术、免疫酶技术等。
1.凝集试验
细菌和红细胞等颗粒性抗原加入相应抗体，在有适量电解质存在下，两者发生特异性结合，并进一步形成肉眼可见的凝集小块。可分为直接凝集反应和间接凝集反应。
（1）直接凝集反应：指颗粒抗原直接与相应抗体结合而出现肉眼可见的凝集小块，具体有玻片法和试管法。玻片凝集反应为定性反应，方法简便快速，常用于细菌的鉴定与分型。
试管凝集反应为定量反应，主要用于检测受试者血清中有无某种特异性抗体及其相对含量。