实验目的
学习并掌握原生质体的制备、再生及融合技术。
实验原理
原生质体融合（protoplast fusion）是将双亲株的微生物细胞分别通过酶解脱壁，使之形成原生质体，然后在高渗的条件下混合，并加入物理的或化学的或生物的助融条件，使双亲株的原生质体间发生相互凝集，通过细胞质融合，核融合，进而发生基因组间的交换重组，可以在适宜的条件下再生出微生物的细胞壁来。从而获得带有双亲性状的、遗传性能稳定的融合子（fusant）的过程。
所用的助融剂聚乙二醇（PEG）是一种特殊的脱水剂，它以分子桥形式在相邻原生质体膜间起中介作用，进而改变质膜的流动性能，降低原生质膜表面势能，使膜中的镶嵌蛋白质颗粒凝聚，形成一层易于融合的无蛋白质颗粒的磷脂双分子层，在Ca2+存在下引起细胞膜表面的电子分布的改变，从而使接触处的质膜形成局部融合，出现凹陷，构成原生质桥，成为细胞间通道并逐渐扩大，直到两个原生质体全部融合。一般以PEG1000～6000较为适用，不同种类微生物对PEG相对分子质量的要求不尽相同。放线菌适用相对分子质量常为1000～1500，也有人使用4000～6000，真菌一般采用4000～6000，细菌用1500～6000.PEG常用浓度为30%～50%，但随微生物种类不同而异，实际工作中要做预备实验。酵母菌原生质体融合时采用低浓度的PEG，常用浓度在20%～35%，真菌在30%左右效果较好，低于20%失去稳定性，导致原生质体破裂，高于30%会引起原生质体皱缩，过高还会产生中毒现象。
双歧杆菌（Bifidobacterium）是人和动物肠道内最主要的生理性细菌之一，具有抗感染、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、改善免疫功能等促进作用。酿酒酵母（Saccharomyces cerevi-siae）用于酿造啤酒、酒精、发酵面包及其他饮料酒。本实验通过原生质体融合技术，将厌氧双歧杆菌和酵母进行原生质体融合，采用10%乳糖中性红培养基进行融合子的初筛，并分析融合子传代稳定性、生物学特性，从而改善了双歧杆菌的耐氧性。
一些试剂，如EDTA、甘氨酸、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、2-脱氧葡萄糖、Triton X100、青霉素等，在一定范围内可增加菌体细胞壁对酶的敏感性，促进原生质体的释放。因此，在双歧杆菌培养时，培养基中加入0.1μg/mL青霉素，以提高其酶解效果。选用0.1mol/L EDTA配制的0.4%（体积分数）β-巯基乙醇作为酵母预处理剂，酶解前处理原生质体。
实验材料
（一）菌种
两歧双歧杆菌（Bifdobacterium bifdum）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。
（二）培养基
（1）TPY培养基（培养基13）。
（2）再生TPY培养基 培养基PYG1L、甘露醇91g、葡萄糖10g、琼脂18g。
（3）液体完全培养基（YPD）蛋白胨20g、葡萄糖20g、酵母膏10g、蒸馏水1L，pH6.5.
（4）固体完全培养基YPD+2%的琼脂。
（5）再生YPD YPD 1L、甘露醇91g、葡萄糖10g、琼脂18g。
（6）乳糖中性红培养基 蛋白胨20g、乳糖100g、酵母膏10g、0.5%中性红5mL、蒸馏水1L、pH7.2.
（7）选择性培养基 乳糖中性红培养基1L、甘露醇91g、琼脂18g。
上述培养基均采用0.1MPa，20min灭菌。
（三）试剂
（1）0.1mol/L、pH6.0磷酸缓冲液（PB）。
（2）高渗溶液0.5mol/L甘露醇（用PB配制），5mg/L DNA酶（微孔过滤除菌后加入）。
（3）原生质体稳定液0.5mol/L蔗糖，0.02mol/L MgCl2，0.02mol/L顺丁烯二酸，pH6.5.
（4）预处理剂 用0.1mol/L EDTA配制的0.4%（体积分数）β-巯基乙醇。
（5）促融剂 用高渗溶液配制的35%聚乙二醇（PEG6000）。
（6）脱壁酶 溶菌酶（Lysozyme）、蜗牛酶（Snailase）、纤维素酶（Cellulase），使用时按所需浓度用高渗溶液配制，微孔过滤除菌。
上述溶液（已注明的除外）均采用0.1MPa，20min灭菌。
实验流程
活化菌种→收集菌体→菌体预处理→酶解脱壁→原生质体再生→原生质体融合→融合子筛选
实验步骤
（一）菌体培养
（1）短双歧杆菌 自新鲜斜面（TPY固体培养基）挑取一环接入TPY液体培养基，37℃厌氧培养24h，将活化好的菌种以1%接种量再接入TPY液体培养基试管中，37℃厌氧培养20～22h至对数生长期，离心收集菌体备用。
（2）啤酒酵母 自新鲜斜面上取菌体一环接种于5mLYPD试管中，30℃活化24h，转接入装有50mLYPD的锥形瓶中，30℃振荡培养16h至对数生长期，离心收集菌体备用。
（二）收集菌体
依次用5mL原生质体稳定液（SMM）和5mL高渗溶液各洗涤离心（3000r/min，10min）一次（酵母先加入EDTA-巯基乙醇预处理剂，30℃保温30min，3000r/min离心）。
（三）原生质体的制备与再生
将离心后的菌体悬浮于5mL高渗溶液中，加入适量酶液（双歧杆菌用溶菌酶，酵母用蜗牛酶+纤维素酶），在设定的温度下酶解一定时间，再用高渗溶液洗涤2次，悬浮于高渗溶液中备用。
同时做酶解前菌落计数（双歧杆菌用PYG培养基、酵母菌用YPD培养基）、酶解后再生菌落（双歧杆菌用再生PYG培养基、酵母菌用再生YPD培养基）及蒸馏水处理原生质体后平板计数（未形成原生质体菌数，双歧杆菌用PYG培养基、酵母菌用YPD培养基），并计算原生质体形成率和原生质体再生率。
（四）原生质体的融合
将亲株原生质体与高渗液等体积混合，4000r/min离心10min，弃上清液后，加入5mL 35%PEG6000，37℃轻轻摇动融合30min后，4000r/min离心10min，高渗溶液洗涤2～3次，用原生质体稳定液稀释后，取0.1mL夹层培养于选择性培养基中，30℃培养4～5d。
（五）融合子的筛选
根据短双歧杆菌和酿酒酵母在分解乳糖上的差别（短双歧杆菌分解乳糖，啤酒酵母不分解乳糖），设计了乳糖中性红培养基作为选择性培养基，用于融合子的筛选。30℃培养48h后长出的红色菌落可疑为双歧杆菌和酿酒酵母融合子。
（六）DNA的提取及（G+C）%（摩尔分数）测定
DNA的提取采用苯酚氯仿混合提取法；DNA的（G+C）%测定；采用熔链温度测定法（Tm）。
（七）融合子的稳定性
由于核融合二倍体能够稳定遗传而异核体则很快会出现分离现象，因此，将上述选择培养基夹层培养长出的融合子菌落，在乳糖中性红培养基平板上有氧条件下连续传代10次（加适量对氟苯丙氨酸PFA处理，加速不稳定融合子的分离），从中筛选出稳定遗传的融合子。
实验结果与报告
（1）绘图说明菌体、原生质体及加入助融剂后原生质体的形态。
（2）计算融合两亲本原生质体的形成率和再生率。
思考题
（1）哪些因素影响原生质体再生？如何提高再生率？
（2）如何挑选出融合子？
（3）PEG助融剂有何作用？
（4）在融合子筛选中如何区分是形成异核体还是形成重组融合子？