1820年5月12日，弗罗伦斯·南丁格尔降生在意大利的历史文化名城佛罗伦萨。她的母亲范妮便以这座城市的名称为她的这个女儿取名。父亲威廉也非常喜爱他们的第二个女儿（一年前他们在希腊的那不勒斯有了第一个爱情的结晶——芭斯诺普）。他们亲昵地称两个女儿为“芭斯”和“弗罗”。南丁格尔拥有一头浓密的栗色头发，一张清秀柔和的脸，优雅出众。尽管父母和睦，生活祥和、幸福，但幼年的南丁格尔却显出了与众不同的古怪个性。她一向喜欢独来独往，很少与小伙伴们在一起游戏。她倔强而执拗，多愁且善感，常表现出与其年龄不相符的自悲自怨。在6岁左右，她就慢慢意识到，这种优裕舒适的生活令她感到孤独和乏味。她很早就喜欢给亲朋好友写信，以此排遣小小内心的沉闷。此外，她还热衷于将受伤的小动物精心治疗养护，从中获得无限的乐趣。父亲威廉是南丁格尔童年时代最好的伙伴。他博学多才，爱好广泛，而且风趣幽默。威廉对女儿的教育非常重视，花费了不少心思，为她们的学习做出周密的安排，并依据她们的个性设计了不同的发展方向。姐妹两个都很聪明，小南丁格尔显得尤为出色。1832年，威廉决定亲自教授她们的主要功课。父亲的课程安排紧凑而严格，芭斯对此很不习惯，但南丁格尔却欣赏父亲的风格。她和父亲一样，喜欢严谨和精确，热爱抽象的事物。在父亲的教育下，不到10岁时，南丁格尔就能自动地用法语来写日记，坚持了有两年时间。她还经常写些笔记，将读书心得和自己的感想写下来，这个习惯几乎贯穿了她一生。
南丁格尔的学习成绩十分出色。17岁前，她就已经读了英国史、外国史和足够的小说及诗歌，研习了数学、心理学，对于各门艺术和各国语言，诸如法语、德语、意大利语、拉丁语和希腊语等，都有所了解，这在当时的少女中是十分罕见的。1837年，在全家准备到国外旅行的前几天，南丁格尔坐在恩珀蕾花园两棵高大的雪松下，突然感到了内心的觉醒。她在日记中写道：“神召唤我来侍奉它。”这应该是她因长期为心事所困扰而产生的幻觉。然而，在这个神谕中，南丁格尔并没有听到上帝叫她具体做哪件事，这使得她既痛苦又迷茫。不过她坚信，自己将成为不平凡的女性，她的命运很可能要与千百万人的命运联系在一起。1837年9月，南丁格尔全家坐上由威廉亲手设计的马车，前往意大利。在那里，南丁格尔不仅感受到了音乐带给她的愉悦，还感受到了意大利奔放自由的热情。在巴黎，她见到了当时法国上流社交圈中的名人克拉克小姐，并对其与著名学者福里尔的纯洁友谊留下了极其深刻的印象。南丁格尔由此获得了一种信念，她开始相信，男女之间同样可以拥有不掺邪念的友情。这后来成为指导她一生的准则之一。
1838年4月，南丁格尔一家回到伦敦。这次旅行使范妮看到，自己的两个女儿都很出色，她准备拟订更为实用的计划，将女儿送入上流社会，各方面都更加突出的南丁格尔完全可以成为杰出的社交人才。但南丁格尔心里逐渐明白，自己首先要克服的诱惑，便是佼佼于社交界的欲望。母亲安排的频繁的社交活动使她有一种虚掷生命的惆怅与不安。为了让心灵有所依托，南丁格尔开始认真地研习起了数学，并且在其中找到了某种寄托和快乐。但由于母亲范妮的坚决反对，南丁格尔不得不中断了对数学的学习。从1839年到1841年，南丁格尔除了读书和写笔记之外，总感觉自己一事无成。她急欲使当前的生活做出改变，却不知从何着手，只有继续潜心学习。1842年，凭着自己的才华和气质，南丁格尔已经开始进入英国知识界。她秀外慧中，博学多知，并且充满活力。尽管她对无休止的社交活动不以为然，但似乎却是无心插柳柳成荫——她不仅在社交方面获了较大成功，而且还经常收到爱情的橄榄枝，但南丁格尔对此没有做出更多的表示。这一年夏天，英国发生了历史性的大饥荒，贫民收容所、医院和监牢之中都挤满了人群。同胞受苦受难的情形让南丁格尔感同身受，她隐隐地明白了上帝的召唤的含义——为穷人服务，为悲惨的人服务。于是她向母亲要来食物、药品和衣物，去救济贫民。同时，她将大部分时光都用在帮助贫穷的农家的事情上。渐渐地，她感悟到，自己的命运并不在优裕而狭隘的个人天地里，而是在广大蒙受苦难的病人当中。但是母亲范妮却认为，浪费时间去护理那些穷人简直荒唐无比，她不顾南丁格尔的多次请求，坚决反对南丁格尔的想法。