抗日战争爆发后，1937年9月成立陕甘宁边区政府，中共中央决定马明方担任边区政府主席团委员兼内政部代部长、民政厅厅长。长期艰苦的革命斗争，他积劳成疾，经中共中央批准于1938年4月赴莫斯科治疗，在苏联期间，他仍时时关心国内抗战局势。
1941年1月，马明方感觉身体稍微好一些了，就坚决要求回国参加革命斗争。当时，中国共产党与新疆的盛世才建立了新疆抗日民族统一战线，在省城迪化（今乌鲁木齐）设立了八路军驻新疆办事处，陈云是首任中共驻新疆代表兼八路军驻新疆办事处主任。在1939年秋至1941年夏期间，我党有一批干部自苏联回国途经新疆时，由于经过兰州、西安去延安的道路被国民党派重兵封锁，使他们被迫滞留于迪化。在马明方从苏联取道新疆回国时，组织上考虑到当时新疆的复杂局势，正需要人手，安排马明方在迪化暂住，担任八路军驻新疆办事处党支部书记。回到祖国后，马明方立刻投入火热的斗争生活，他协助八路军驻新疆办事处主任邓发等同志组织干部培训、开展宣传教育等工作，为维护新疆的和平稳定作出了积极努力。
国民党顽固派不断掀起反共逆流，制造了震惊中外的“皖南事变”，中国共产党及其领导的八路军进入抗日战争的艰苦时期。在此形势下，惯于搞政治投机的新疆军阀盛世才，完全暴露其反苏反共的真面目，将中共在新疆的100多名共产党干部监禁、逮捕，投入监狱，这些干部受到了非人的待遇和种种折磨。监狱当局将所有人员分开关押，分别投入4个监狱，马明方先被关押在第4监狱，后又转押至第1、第2监狱。
马明方被捕后，在狱中与反动势力进行了不屈不挠的斗争。盛世才劝他，只要放弃信仰，脱离共产党，就可立即释放。他当着审讯者的面严词拒绝。在狱中，国民党顽固派用尽了各种酷刑，但他始终坚贞不屈，表现了一个共产党员崇高的革命气节。在一次审讯中，国民党法官诬蔑八路军破坏抗战，是“匪”。他怒不可遏，痛斥敌人：“你们完全是一派胡言，八路军在前线坚持抗战，你们不抗战，却在这里残害八路军，究竟谁破坏抗战，谁是土匪？”主审法官恼羞成怒，几个狱卒蜂拥而上，乱棍齐下，把他打得遍体鳞伤。但他大义凛然，继续揭露国民党顽固派和盛世才破坏抗战的罪行。主审法官无计可施，只好下令把他拖回监狱。
盛世才及其反动势力见用酷刑逼迫共产党人就范的办法无效，又企图用填登记表的方法削弱共产党人的斗志，声称：只要在表格的“志愿”、“信仰”两栏内填上“愿意回家”、“不再跟共产党走”，就发给路费，立即释放回家。马明方洞察其奸，当着监狱众多官吏的面把表填好：“信仰：共产主义；志愿：回延安！”弄得敌人目瞪口呆。
在监狱，马明方积极参与领导狱中斗争，先后组织了三次“反普遍审讯”、三次绝食斗争，实现了狱中党组织提出的“变监狱为战场”、“变监狱为学校”的战斗口号。他时常教育大家要坚决与叛徒斗争，并带领大家唱《国际歌》，学唱《囚徒歌》：“坚定信念，贞守立场，砍头枪毙，告老还乡……掷我们的头颅，奠筑自由的金字塔；洒我们的鲜血，染成红旗，万载飘扬。”马明方坚定的共产主义信念和顽强的斗争精神，使国民党顽固派非常害怕，惊叹：“长此羁押，恐非善果。”
盛世才调离新疆后，蒋介石任命吴忠信为新疆省主席，他一上台仍顽固执行盛世才的反共反人民政策。马明方及狱中党组织适时提出了“百子一条心，集体无条件释放回延安”的口号，使全体共产党员更加紧密地团结起来，揭露了盛世才残酷杀害陈潭秋、毛泽民、林基路的罪行，挫败了国民党策反狱中党员的阴谋。
中共党员在新疆被盛世才软禁关押的消息，很快由共产国际转递给中共中央，党中央迅速电请在八路军驻重庆办事处工作的周恩来设法营救。重庆谈判时，毛泽东、周恩来还向蒋介石提出释放关押在新疆监狱的中共人员问题。
1946年3月，张治中被任命为国民政府西北行辕主任兼新疆省主席，他受周恩来的嘱托，一上任就决定“释放政治犯”。1945年4月，中共七大在延安召开，当时还在新疆监狱里的马明方，被选为七届中央委员会候补委员。经过多方努力，马明方等100多名中共党员由张治中派员护送于7月11日返回延安，受到毛泽东、朱德等中央领导同志和边区人民的热烈欢迎。
马明方等人胜利返回延安后不久，除向刘少奇口头汇报了中共人员在新疆狱中斗争情况外，还认真深入总结经验教训，写出了《在新疆监狱中反法西斯斗争经过报告》，报送中央组织部，这些史料为中共党员在新疆的革命工作留下了翔实的依据。然而，也正是这段不平凡的经历，让马明方在后来的岁月中屡遭迫害，以至于被戴上了“叛徒”的帽子。